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背景：
异常活跃的有氧糖酵解，即著名的“Warburg效应”，是肿瘤细胞最显著的代谢特点，其主要表现为：即使在氧气充足的状态下，肿瘤细胞仍主要以糖酵解方式代谢葡萄糖并产生大量乳酸，而非通过线粒体氧化磷酸化方式代谢葡萄糖。越来越多的研究证据表明，有氧糖酵解增强与肿瘤的发生发展高度相关，主要通过如下机制参与肿瘤恶性进展：首先，葡萄糖经糖酵解代谢的中间产物可为肿瘤细胞的快速增殖提供氨基酸、核苷酸及脂类等生物大分子合成的原料；其次，糖酵解产生还原性的NADPH可对抗细胞内活性氧ROS导致的氧化应激；再次，肿瘤细胞将糖酵解生成的乳酸分泌至胞外环境，可促进细胞的侵袭与转移；最后，糖酵解代谢方式可使肿瘤细胞更好的适应缺氧环境。以往研究证实细胞内癌基因及相关通路激活，或抑癌基因及相关通路失活在肿瘤糖酵解增强中发挥重要的调控作用。然而，膜蛋白作为介导胞外信号传递的一类重要分子，其在肿瘤糖酵解中的作用却少有研究。
GPC3(glypican 3)是一种跨膜糖蛋白，研究证实GPC3在细胞生长、分化和迁移等过程中发挥重要作用。近年来研究发现，GPC3在正常肝组织中几乎不表达，而在肝癌细胞中表达却异常升高，是潜在的肝癌诊断与预后判断标志。GPC3可通过激活细胞内PI3K/Akt、β-catienin等促癌信号参与肝癌细胞增殖与转移调控。然而，GPC3在糖代谢重编程中的作用尚不清楚。本课题旨在探讨细胞膜蛋白GPC3在肝癌细胞糖酵解中的调控作用与机制。
目的：
1.明确GPC3在肝癌细胞糖酵解中的调控作用。2.探讨GPC3在肝癌细胞氧化磷酸化中的调控作用。3.阐明GPC3调控肝癌细胞有氧糖酵解与氧化磷酸化的分子机制。
方法：
利用siRNA(small interfering RNA)下调GPC3表达后：1.通过检测肝癌细胞培养液中葡萄糖的减少量，分析GPC3对细胞葡萄糖摄取的影响。2.通过检测肝癌细胞培养液中乳酸的生成量与培养液的PH值，分析GPC3对细胞乳酸产生的影响。3.通过检测肝癌细胞氧耗速率，分析GPC3对线粒体氧化磷酸化的影响。4.通过检测肝癌细胞ATP的生成量，分析GPC3对线粒体氧化磷酸化的影响。5.通过检测肝癌细胞线粒体中5个呼吸链复合体活性，分析GPC3对线粒体氧化磷酸化的影响。6.采用qRT-PCR(quantitative real-time PCR)与Westernblot实验，检测糖酵解调控关键酶Glut1(glucose transporter-1)、HK2(hexokinase 2)与LDH-A(lactate dehydrogenase A)的表达，以明确GPC3是否通过调控上述酶表达而促进肝癌细胞有氧糖酵解。7.采用qRT-PCR(quantitative real-time PCR)与Westernblot实验，检测促线粒体生物发生关键蛋白PGC1α的表达，分析GPC3是否通过抑制线粒体生物发生而抑制氧化磷酸化。8.用免疫组化对50例肝癌患者组织标本中GPC3、糖酵解关键酶HK2、Glut1和LDH-A，与线粒体生物发生关键调控因子PGC1α的表达进行分析，随后对GPC3与HK2、Glut1和LDH-A，及PGC1α表达的相关性进行分析，在临床样本中验证体外细胞实验所得结论。9.检测GPC3对HIF1α的调控作用。检测HIF1a是否介导GPC3对Glut1，HK2，LDH-A表达的调控，是否介导GPC3对PGC1a表达的调控，是否介导GPC3对糖酵解与氧化磷酸化的调控。10.检测HIF1a是否介导GPC3对肝癌生长转移调控的体外实验和体内实验。
结果：
用siRNA下调GPC3表达后：1.肝癌细胞对葡萄糖的摄取速率明显降低。2.肝癌细胞培养上清中乳酸含量显著减少，PH值明显升高。3.肝癌细胞对氧气的消耗速率显著升高。4.肝癌细胞ATP的生成量显著增多。5.肝癌细胞线粒体氧化呼吸链复合体Ⅰ、复合体Ⅱ、复合体Ⅲ、复合体Ⅳ与复合体Ⅴ的活性均显著升高。6.糖酵解关键调控分子Glut1、HK2与LDH-A在mRNA与蛋白水平的表达均显著降低。7.线粒体生物发生关键调控因子PGC1α在mRNA与蛋白水平的表达均显著增加。8.肝癌组织细胞中GPC3与HK2、Glut1和LDH-A表达正相关；GPC3与PGC1α的表达负相关。进一步支持体外细胞实验中的结果，即GPC3可能通过上调糖酵解关键酶Glut1，HK2与LDH-A表达而促进肝癌细胞糖酵解，通过下调PGC1α表达而抑制肝癌细胞氧化磷酸化。9.检测GPC3对HIF1α的调控作用：下调GPC3后，Hif1a的mRNA与蛋白表达水平均显著下降，而过表达GPC3后，Hif1a的mRNA与蛋白表达水平均显著上升。干扰GPC3后过表达HIF1a：检测Glut1，HK2，LDH-A的mRNA与蛋白表达水平均显著上升；肝癌细胞的PGC1a分子的mRNA与蛋白表达水平均显著下降；肝癌细胞的葡萄糖摄取、乳酸产生显著上升；胞外PH值、细胞氧耗、ATP产生显著下降；肝癌细胞的氧化呼吸链复合体1，2，3，4，5活性均显著下降。10.体外实验和体内实验证明：干扰GPC3后过表达HIF1a，过表达的HIF-1α可以强劲恢复GPC3下调后抑制的肝癌细胞的生长和转移。
结论：
GPC3在肝癌细胞糖代谢重编程中发挥重要的调控作用。GPC3可促进肝癌细胞有氧糖酵解，同时抑制线粒体氧化磷酸化。其中，Glut1、HK2与LDH-A的表达上调介导了GPC3对肝癌细胞糖酵解的促进作用；PGC1α的表达下调介导了GPC3对肝癌细胞氧化磷酸化的抑制。GPC3可以调控HIF-1α的表达。HIF-1α过表达，可以强力逆转GPC3下调对糖酵解的抑制作用。
异常活跃的有氧糖酵解，即著名的“Warburg效应”，是肿瘤细胞最显著的代谢特点，其主要表现为：即使在氧气充足的状态下，肿瘤细胞仍主要以糖酵解方式代谢葡萄糖并产生大量乳酸，而非通过线粒体氧化磷酸化方式代谢葡萄糖。越来越多的研究证据表明，有氧糖酵解增强与肿瘤的发生发展高度相关，主要通过如下机制参与肿瘤恶性进展：首先，葡萄糖经糖酵解代谢的中间产物可为肿瘤细胞的快速增殖提供氨基酸、核苷酸及脂类等生物大分子合成的原料；其次，糖酵解产生还原性的NADPH可对抗细胞内活性氧ROS导致的氧化应激；再次，肿瘤细胞将糖酵解生成的乳酸分泌至胞外环境，可促进细胞的侵袭与转移；最后，糖酵解代谢方式可使肿瘤细胞更好的适应缺氧环境。以往研究证实细胞内癌基因及相关通路激活，或抑癌基因及相关通路失活在肿瘤糖酵解增强中发挥重要的调控作用。然而，膜蛋白作为介导胞外信号传递的一类重要分子，其在肿瘤糖酵解中的作用却少有研究。
GPC3(glypican 3)是一种跨膜糖蛋白，研究证实GPC3在细胞生长、分化和迁移等过程中发挥重要作用。近年来研究发现，GPC3在正常肝组织中几乎不表达，而在肝癌细胞中表达却异常升高，是潜在的肝癌诊断与预后判断标志。GPC3可通过激活细胞内PI3K/Akt、β-catienin等促癌信号参与肝癌细胞增殖与转移调控。然而，GPC3在糖代谢重编程中的作用尚不清楚。本课题旨在探讨细胞膜蛋白GPC3在肝癌细胞糖酵解中的调控作用与机制。
目的：
1.明确GPC3在肝癌细胞糖酵解中的调控作用。2.探讨GPC3在肝癌细胞氧化磷酸化中的调控作用。3.阐明GPC3调控肝癌细胞有氧糖酵解与氧化磷酸化的分子机制。
方法：
利用siRNA(small interfering RNA)下调GPC3表达后：1.通过检测肝癌细胞培养液中葡萄糖的减少量，分析GPC3对细胞葡萄糖摄取的影响。2.通过检测肝癌细胞培养液中乳酸的生成量与培养液的PH值，分析GPC3对细胞乳酸产生的影响。3.通过检测肝癌细胞氧耗速率，分析GPC3对线粒体氧化磷酸化的影响。4.通过检测肝癌细胞ATP的生成量，分析GPC3对线粒体氧化磷酸化的影响。5.通过检测肝癌细胞线粒体中5个呼吸链复合体活性，分析GPC3对线粒体氧化磷酸化的影响。6.采用qRT-PCR(quantitative real-time PCR)与Westernblot实验，检测糖酵解调控关键酶Glut1(glucose transporter-1)、HK2(hexokinase 2)与LDH-A(lactate dehydrogenase A)的表达，以明确GPC3是否通过调控上述酶表达而促进肝癌细胞有氧糖酵解。7.采用qRT-PCR(quantitative real-time PCR)与Westernblot实验，检测促线粒体生物发生关键蛋白PGC1α的表达，分析GPC3是否通过抑制线粒体生物发生而抑制氧化磷酸化。8.用免疫组化对50例肝癌患者组织标本中GPC3、糖酵解关键酶HK2、Glut1和LDH-A，与线粒体生物发生关键调控因子PGC1α的表达进行分析，随后对GPC3与HK2、Glut1和LDH-A，及PGC1α表达的相关性进行分析，在临床样本中验证体外细胞实验所得结论。9.检测GPC3对HIF1α的调控作用。检测HIF1a是否介导GPC3对Glut1，HK2，LDH-A表达的调控，是否介导GPC3对PGC1a表达的调控，是否介导GPC3对糖酵解与氧化磷酸化的调控。10.检测HIF1a是否介导GPC3对肝癌生长转移调控的体外实验和体内实验。
结果：
用siRNA下调GPC3表达后：1.肝癌细胞对葡萄糖的摄取速率明显降低。2.肝癌细胞培养上清中乳酸含量显著减少，PH值明显升高。3.肝癌细胞对氧气的消耗速率显著升高。4.肝癌细胞ATP的生成量显著增多。5.肝癌细胞线粒体氧化呼吸链复合体Ⅰ、复合体Ⅱ、复合体Ⅲ、复合体Ⅳ与复合体Ⅴ的活性均显著升高。6.糖酵解关键调控分子Glut1、HK2与LDH-A在mRNA与蛋白水平的表达均显著降低。7.线粒体生物发生关键调控因子PGC1α在mRNA与蛋白水平的表达均显著增加。8.肝癌组织细胞中GPC3与HK2、Glut1和LDH-A表达正相关；GPC3与PGC1α的表达负相关。进一步支持体外细胞实验中的结果，即GPC3可能通过上调糖酵解关键酶Glut1，HK2与LDH-A表达而促进肝癌细胞糖酵解，通过下调PGC1α表达而抑制肝癌细胞氧化磷酸化。9.检测GPC3对HIF1α的调控作用：下调GPC3后，Hif1a的mRNA与蛋白表达水平均显著下降，而过表达GPC3后，Hif1a的mRNA与蛋白表达水平均显著上升。干扰GPC3后过表达HIF1a：检测Glut1，HK2，LDH-A的mRNA与蛋白表达水平均显著上升；肝癌细胞的PGC1a分子的mRNA与蛋白表达水平均显著下降；肝癌细胞的葡萄糖摄取、乳酸产生显著上升；胞外PH值、细胞氧耗、ATP产生显著下降；肝癌细胞的氧化呼吸链复合体1，2，3，4，5活性均显著下降。10.体外实验和体内实验证明：干扰GPC3后过表达HIF1a，过表达的HIF-1α可以强劲恢复GPC3下调后抑制的肝癌细胞的生长和转移。
结论：
GPC3在肝癌细胞糖代谢重编程中发挥重要的调控作用。GPC3可促进肝癌细胞有氧糖酵解，同时抑制线粒体氧化磷酸化。其中，Glut1、HK2与LDH-A的表达上调介导了GPC3对肝癌细胞糖酵解的促进作用；PGC1α的表达下调介导了GPC3对肝癌细胞氧化磷酸化的抑制。GPC3可以调控HIF-1α的表达。HIF-1α过表达，可以强力逆转GPC3下调对糖酵解的抑制作用。