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缺血性脑卒中是危害人类健康的重大疾病之一。目前缺血性脑卒中的主要治疗策略是溶栓等血液再灌注以及神经保护治疗。然而血栓自溶与溶栓治疗继发的脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury, CI/RI)却严重影响了治疗效果，成为病情加重的关键因素。CI/RI的病理机制复杂，并且互为因果，相互联系，形成一个快速的逐级连锁反应，这些反应主要包括能量障碍、兴奋性氨基酸毒性、氧自由基累积、炎症反应及细胞凋亡等多个病理生理环节。许多在临床试验中没有得到预期效果的神经保护药物，其可能是由于CI/RI病理过程的连锁反应，使得临床上任何阻断单一环节的药物都难以凑效。因此，人们一直不断地在积极寻找和探索新的神经保护剂，即具备对CI/RI过程中多个环节、多个靶点发挥多重保护作用的特性。
离子通道是细胞膜上的关键“门户”，在许多重要的生命过程中发挥巨大作用。其中阴离子通道在维持组织细胞的内环境稳定，调节细胞的容积、细胞增殖及细胞凋亡中起着重要的作用。研究表明，体积调节阴离子通道(volumeregulatedanionchannel，VRAC；又称为容积敏感性外向整流氯离子通道)所致内环境紊乱是缺血性脑卒中的主要危险因素，与继发脑损伤的脑水肿、炎性反应等病理因素密切相关。在体外氧糖剥夺诱导神经细胞损伤以及在体脑缺血再灌注损伤的相关研究方面，发现特异性阴离子通道阻断剂DCPIB和非特异性阻断剂DIDS能有效抑制细胞凋亡，减轻神经受损，达到保护神经的作用。然而，由于氯通道阻断剂的药理特性，目前其应用仅保留在实验室工具药水平，且较少的种类数量均为国外试剂公司所生产。如果能在资源丰富的传统中草药中开发出具有阴离子通道阻断效应的天然化合物，那么对于相关疾病的治疗将会提供一新的希望。
NorcepharadioneB(NB，中文名：去甲头花千金藤二酮B)是提取自传统中草药鱼腥草的一种阿朴菲型生物碱，国内外多项研究表明，其具有较强的抗病毒、抗炎、抗肿瘤及抗血小板聚集等多种生物学作用；在神经系统方面，研究发现NB对中枢神经系统肿瘤(XF-498细胞系)具有良好的抑制作用。本课题组长期致力于氯离子通道的相关研究，前期通过高通量筛选技术，从近7000种天然化合物中，筛选出7种阴离子通道阻断剂的候选化合物，并进一步采用电生理膜片钳技术检测，明确了NB对低渗及过氧化氢诱导心肌H9C2细胞及Hela细胞的氯离子通道的阻断效应。那么NB对神经细胞的氯通道电流有无影响？是否还可通过其它生物学活性发挥神经保护作用？目前NB在神经保护方面的研究尚无报道。
神经系统主要是由承担主要功能活动的神经元和起着支持、保护作用的胶质细胞所组成。神经元对缺血最为敏感，尤其是发生缺血再灌注损伤时海马区及大脑皮层神经元最易受损；而小胶质细胞所介导的神经炎性是缺血再灌注脑损伤的主要病理机制之一。为此，本研究采用小鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型为研究对象，观察NB对小鼠脑I/R损伤的干预作用及可能机制；并采用H2O2诱导小鼠海马神经元(HT22)损伤模拟氧化应激模型以及经典致炎诱导剂脂多糖(LPS)诱导小鼠小胶质细胞(N9)模拟炎性损伤模型，探讨NB发挥神经保护作用的潜在机制和相关分子通路，实验内容共分三部分。
第一部分NB对脑缺血再灌注损伤模型小鼠的作用研究
目的：观察NB在脑缺血再灌注损伤的作用及可能的机制。
方法：采用大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)法建立脑缺血再灌注损伤小鼠模型。实验分组按两部分进行：(一)首先小鼠随机分成七组：假手术(sham)组、模型组(I/R)组、Eda(edaravone)+I/R组、DCPIB+I/R组、NB各剂量组(10mg, 20mg, 30mg/kg)+I/R，24小时后观察：小鼠行为学、梗死面积及组织病理形态，评价NB对脑损伤的影响，确定NB发挥神经保护作用的最佳有效浓度。(二)小鼠随机分为三组：sham组、I/R组、NB+I/R组，观察NB对大脑皮层组织中细胞凋亡、脑组织中氧化损伤指标和炎性因子的影响；并通过免疫荧光和Westernblot检测抗氧化通路相关蛋白Nrf2、HO-1和炎症反应相关蛋白NF-κВ、TNF-α及IL-1β的表达情况。
结果：
(1)行为学及梗死体积评价结果显示，I/R小鼠出现不能完全伸展对侧前爪，或向对侧转圈或向对侧倾倒等的神经损伤症状，其行为学评分与sham组有显著性差异(P＜0.05，n=8)，提示成功构建了大脑中动脉阻塞(MCAO)小鼠模型；NB(20和30mg)处理组与I/R组相比可明显降低行为学评分(P＜0.05，n=8),而NB(10mg)组与I/R组相比无显著差异(P＞0.05，n=8)；Eda组及DCPIB组的行为学评分显著改善(P＜0.05，n=8)。TTC染色结果与行为学结果一致，sham组的脑组织无梗塞。NB(10mg)剂量组与I/R组比较，无显著性差异(P＞0.05，n=8)；NB(20和30mg)以及Eda组和DCPIB组均可显著缩小缺血侧脑组织梗塞体积(P＜0.05，n=8)。NB30mg组较NB20mg组对缺血后行为学改善及梗死体积减少更明显(P＜0.05，n=8)，确定NB30mg为最佳干预剂量。
(2)小鼠脑组织细胞形态学检测，HE染色结果显示：sham组的脑组织细胞形态规则，连接紧密。I/R组的细胞周围间隙增宽，细胞核呈深染固縮，部分胞质自溶，周围出现较大空泡。各给药组(NB组、Eda组和DCPIB组)的小鼠均可见神经细胞缺血性改变减轻，细胞轻度肿胀，坏死细胞数量减少，与I/R组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05，n=6)。
(3)Tunnel检测结果提示，与sham组比较，I/R组阳性细胞明显增多(P＜0.05，n=6)。NB(30mg)处理组可明显减少阳性细胞的数量(P＜0.05，n=6)。
(4)生化指标的检测结果显示，与sham组比较，I/R组SOD及GSH水平明显降低(P＜0.05，n=6)，MDA及TNF-α、IL-1β的含量明显升高(P＜0.05，n=6)，NB处理可增加SOD及GSH水平，减少MDA及TNF-α、IL-1β的水平(P＜0.05，n=6)。
(5)免疫荧光染色结果显示，sham组Nrf2和HO-1染色的细胞较少。I/R处理后可增加缺血皮质区Nrf2和HO-1染色细胞数量，NB处理则显著增强Nrf2和HO-1染色细胞数量,这一结果与Nrf2、HO-1表达的WB检测结果相一致(P＜0.05，n=6)。
(6)Westernblot检测结果显示，NB可促进抗氧化相关分子Nrf2、HO-1表达，减少炎症相关因子NF-κВ、TNF-α及IL-1β的蛋白水平(P＜0.05，n=6)。
结论：NB具有改善CI/RI小鼠行为学、减少梗死面积、减少细胞凋亡，发挥脑功能保护的作用，与VRAC阻断剂DCPIB相一致；NB通过激活抗氧化及抗炎信号通路，减轻I/R脑损伤从而对缺血脑组织起到神经保护作用。
第二部分NB对H2O2诱导海马神经元损伤的作用研究
目的：观察NB对H2O2诱导海马神经元细胞损伤的作用及机制。
方法：采用300μMH2O2诱导海马神经元HT22细胞系模拟缺血再灌注氧化应激损伤，制备体外细胞模型。实验分组：对照组、H2O2组、H2O2+NB组、NB组、H2O2+NAC组以及H2O2+DCPIB组；采用CCK-8法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞容积变化，生化试剂盒检测细胞SOD、GSH、MDA及细胞上清液LDH的水平，Westernblot及PCR法检测相关蛋白表达及RNA表达，全细胞膜片钳技术检测细胞的VRAC的Cl-电流变化。鉴于本实验主要观察NB的效应，故而DCPIB组作为阳性对照组仅观察其对海马神经元细胞的存活及损伤的影响，蛋白层面暂不深入探讨。
结果：
(1)CCK-8检测结果显示，与H2O2组相比，NB组、NAC组或DCPIB组均可减轻H2O2引起的细胞存活率下降(P＜0.05，n=20)、LDH释放增多(P＜0.05，n=20)，而一定浓度范围内单纯NB使用并未对细胞造成明显损伤(P＞0.05，n=20)。
(2)细胞容积检测结果提示，H2O2于不同时间点作用于海马神经元细胞后，细胞体积从2h开始逐渐增大，4～6h时体积显著增大(P＜0.05，n=5)。而NB作用则可抑制细胞肿胀，尤其是在处理4h和6h时抑制作用显著(P＜0.05，n=5)。
(3)细胞凋亡检测结果提示，加入NB及NAC可有效减轻H2O2导致的海马神经元细胞凋亡，且促凋亡蛋白Bax表达明显减轻(P＜0.05，n=3)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达较H2O2组明显增加(P＜0.05，n=3)。
(4)氧化损伤检测结果提示抗氧化指标SOD、GSH在NB组及NAC组较H2O2组有显著升高，而MDA水平则下降(P＜0.05，n=15)。
(5)WB检测结果显示，H2O2可升高Akt的磷酸化水平，给予NB处理可进一步增强Akt磷酸化及HO-1表达水平；加入PI3K抑制剂LY294002后，NB对磷酸化Akt的表达则受到抑制。
(6)膜片钳检测显示，在等渗条件下，500μM的H2O2作用10～15分钟能激活VRAC的Cl-电流，而给予NB处理后可以显著抑制H2O2激活的VRACCl-电流(5-6分钟，83.05±3.87%，P＜0.05，n=5)。
结论：NB具有抑制H2O2诱发神经元VRAC氯离子电流的通道阻断作用，稳定细胞内环境，从而发挥神经保护作用；同时，NB通过激活PI3K/Akt信号通路，增加抗氧化酶HO-1的表达，从而提高内源性抗氧化水平减轻H2O2诱导的神经元凋亡性损伤。
第三部分NB对LPS诱导小胶质细胞炎性损伤的作用研究
目的：探讨NB对LPS诱导小胶质细胞炎性损伤的作用及可能的机制。
方法：采用经典致炎诱导剂LPS诱导小胶质细胞N9细胞系模拟缺血再灌注炎症损伤的病理因素，建立体外神经炎性细胞模型。实验分为4组：正常对照组，LPS组，LPS+NB组以及LPS+DCPIB组。采用ELISA法以及RT-PCR检测NB对炎症因子TNF-α、IL-1β释放以及mRNA表达的影响；采用siRNA干扰下调VRAC蛋白LRRC8A，Western-blot技术检测干扰后各LRRC8A的蛋白片段表达情况；并检测下调LRRC8A后各处理组TNF-α、IL-1β的mRNA的水平。
结果：
(1)不同浓度的NB(50、100及200μM)或者联合LPS(1μg/ml)共同作用于N9细胞24h，CCK-8检测显示对小胶质细胞存活率无明显影响。
(2)ELISA法检测显示：与正常对照组相比，LPS组的细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的分泌明显增高(P＜0.05，n=3)，与LPS组相比，NB+LPS组和LPS+DCPIB组的TNF-α、IL-1β的分泌显著降低(P＜0.05，n=3)。
(3)RT-PCR检测显示：与正常对照组相比，LPS能诱导炎性因子TNF-α、IL-1βmRNA的表达显著增高(P＜0.05，n=3)；与LPS组相比，NB组和DCPIB组及siRNA-LRRC8A组的TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平显著降低(P＜0.05，n=3)。
结论：在小胶质细胞炎性损伤过程中，无论是药源NB及DCPIB阻断VRAC，还是siRNA干扰VRAC蛋白LRRC8A，均能够抑制小胶质细胞活化，减少炎性因子TNF-α及IL-1β的释放，提示VRAC参与了LPS诱导的小胶质细胞炎症损伤过程。
离子通道是细胞膜上的关键“门户”，在许多重要的生命过程中发挥巨大作用。其中阴离子通道在维持组织细胞的内环境稳定，调节细胞的容积、细胞增殖及细胞凋亡中起着重要的作用。研究表明，体积调节阴离子通道(volumeregulatedanionchannel，VRAC；又称为容积敏感性外向整流氯离子通道)所致内环境紊乱是缺血性脑卒中的主要危险因素，与继发脑损伤的脑水肿、炎性反应等病理因素密切相关。在体外氧糖剥夺诱导神经细胞损伤以及在体脑缺血再灌注损伤的相关研究方面，发现特异性阴离子通道阻断剂DCPIB和非特异性阻断剂DIDS能有效抑制细胞凋亡，减轻神经受损，达到保护神经的作用。然而，由于氯通道阻断剂的药理特性，目前其应用仅保留在实验室工具药水平，且较少的种类数量均为国外试剂公司所生产。如果能在资源丰富的传统中草药中开发出具有阴离子通道阻断效应的天然化合物，那么对于相关疾病的治疗将会提供一新的希望。
NorcepharadioneB(NB，中文名：去甲头花千金藤二酮B)是提取自传统中草药鱼腥草的一种阿朴菲型生物碱，国内外多项研究表明，其具有较强的抗病毒、抗炎、抗肿瘤及抗血小板聚集等多种生物学作用；在神经系统方面，研究发现NB对中枢神经系统肿瘤(XF-498细胞系)具有良好的抑制作用。本课题组长期致力于氯离子通道的相关研究，前期通过高通量筛选技术，从近7000种天然化合物中，筛选出7种阴离子通道阻断剂的候选化合物，并进一步采用电生理膜片钳技术检测，明确了NB对低渗及过氧化氢诱导心肌H9C2细胞及Hela细胞的氯离子通道的阻断效应。那么NB对神经细胞的氯通道电流有无影响？是否还可通过其它生物学活性发挥神经保护作用？目前NB在神经保护方面的研究尚无报道。
神经系统主要是由承担主要功能活动的神经元和起着支持、保护作用的胶质细胞所组成。神经元对缺血最为敏感，尤其是发生缺血再灌注损伤时海马区及大脑皮层神经元最易受损；而小胶质细胞所介导的神经炎性是缺血再灌注脑损伤的主要病理机制之一。为此，本研究采用小鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型为研究对象，观察NB对小鼠脑I/R损伤的干预作用及可能机制；并采用H2O2诱导小鼠海马神经元(HT22)损伤模拟氧化应激模型以及经典致炎诱导剂脂多糖(LPS)诱导小鼠小胶质细胞(N9)模拟炎性损伤模型，探讨NB发挥神经保护作用的潜在机制和相关分子通路，实验内容共分三部分。
第一部分NB对脑缺血再灌注损伤模型小鼠的作用研究
目的：观察NB在脑缺血再灌注损伤的作用及可能的机制。
方法：采用大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)法建立脑缺血再灌注损伤小鼠模型。实验分组按两部分进行：(一)首先小鼠随机分成七组：假手术(sham)组、模型组(I/R)组、Eda(edaravone)+I/R组、DCPIB+I/R组、NB各剂量组(10mg, 20mg, 30mg/kg)+I/R，24小时后观察：小鼠行为学、梗死面积及组织病理形态，评价NB对脑损伤的影响，确定NB发挥神经保护作用的最佳有效浓度。(二)小鼠随机分为三组：sham组、I/R组、NB+I/R组，观察NB对大脑皮层组织中细胞凋亡、脑组织中氧化损伤指标和炎性因子的影响；并通过免疫荧光和Westernblot检测抗氧化通路相关蛋白Nrf2、HO-1和炎症反应相关蛋白NF-κВ、TNF-α及IL-1β的表达情况。
结果：
(1)行为学及梗死体积评价结果显示，I/R小鼠出现不能完全伸展对侧前爪，或向对侧转圈或向对侧倾倒等的神经损伤症状，其行为学评分与sham组有显著性差异(P＜0.05，n=8)，提示成功构建了大脑中动脉阻塞(MCAO)小鼠模型；NB(20和30mg)处理组与I/R组相比可明显降低行为学评分(P＜0.05，n=8),而NB(10mg)组与I/R组相比无显著差异(P＞0.05，n=8)；Eda组及DCPIB组的行为学评分显著改善(P＜0.05，n=8)。TTC染色结果与行为学结果一致，sham组的脑组织无梗塞。NB(10mg)剂量组与I/R组比较，无显著性差异(P＞0.05，n=8)；NB(20和30mg)以及Eda组和DCPIB组均可显著缩小缺血侧脑组织梗塞体积(P＜0.05，n=8)。NB30mg组较NB20mg组对缺血后行为学改善及梗死体积减少更明显(P＜0.05，n=8)，确定NB30mg为最佳干预剂量。
(2)小鼠脑组织细胞形态学检测，HE染色结果显示：sham组的脑组织细胞形态规则，连接紧密。I/R组的细胞周围间隙增宽，细胞核呈深染固縮，部分胞质自溶，周围出现较大空泡。各给药组(NB组、Eda组和DCPIB组)的小鼠均可见神经细胞缺血性改变减轻，细胞轻度肿胀，坏死细胞数量减少，与I/R组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05，n=6)。
(3)Tunnel检测结果提示，与sham组比较，I/R组阳性细胞明显增多(P＜0.05，n=6)。NB(30mg)处理组可明显减少阳性细胞的数量(P＜0.05，n=6)。
(4)生化指标的检测结果显示，与sham组比较，I/R组SOD及GSH水平明显降低(P＜0.05，n=6)，MDA及TNF-α、IL-1β的含量明显升高(P＜0.05，n=6)，NB处理可增加SOD及GSH水平，减少MDA及TNF-α、IL-1β的水平(P＜0.05，n=6)。
(5)免疫荧光染色结果显示，sham组Nrf2和HO-1染色的细胞较少。I/R处理后可增加缺血皮质区Nrf2和HO-1染色细胞数量，NB处理则显著增强Nrf2和HO-1染色细胞数量,这一结果与Nrf2、HO-1表达的WB检测结果相一致(P＜0.05，n=6)。
(6)Westernblot检测结果显示，NB可促进抗氧化相关分子Nrf2、HO-1表达，减少炎症相关因子NF-κВ、TNF-α及IL-1β的蛋白水平(P＜0.05，n=6)。
结论：NB具有改善CI/RI小鼠行为学、减少梗死面积、减少细胞凋亡，发挥脑功能保护的作用，与VRAC阻断剂DCPIB相一致；NB通过激活抗氧化及抗炎信号通路，减轻I/R脑损伤从而对缺血脑组织起到神经保护作用。
第二部分NB对H2O2诱导海马神经元损伤的作用研究
目的：观察NB对H2O2诱导海马神经元细胞损伤的作用及机制。
方法：采用300μMH2O2诱导海马神经元HT22细胞系模拟缺血再灌注氧化应激损伤，制备体外细胞模型。实验分组：对照组、H2O2组、H2O2+NB组、NB组、H2O2+NAC组以及H2O2+DCPIB组；采用CCK-8法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞容积变化，生化试剂盒检测细胞SOD、GSH、MDA及细胞上清液LDH的水平，Westernblot及PCR法检测相关蛋白表达及RNA表达，全细胞膜片钳技术检测细胞的VRAC的Cl-电流变化。鉴于本实验主要观察NB的效应，故而DCPIB组作为阳性对照组仅观察其对海马神经元细胞的存活及损伤的影响，蛋白层面暂不深入探讨。
结果：
(1)CCK-8检测结果显示，与H2O2组相比，NB组、NAC组或DCPIB组均可减轻H2O2引起的细胞存活率下降(P＜0.05，n=20)、LDH释放增多(P＜0.05，n=20)，而一定浓度范围内单纯NB使用并未对细胞造成明显损伤(P＞0.05，n=20)。
(2)细胞容积检测结果提示，H2O2于不同时间点作用于海马神经元细胞后，细胞体积从2h开始逐渐增大，4～6h时体积显著增大(P＜0.05，n=5)。而NB作用则可抑制细胞肿胀，尤其是在处理4h和6h时抑制作用显著(P＜0.05，n=5)。
(3)细胞凋亡检测结果提示，加入NB及NAC可有效减轻H2O2导致的海马神经元细胞凋亡，且促凋亡蛋白Bax表达明显减轻(P＜0.05，n=3)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达较H2O2组明显增加(P＜0.05，n=3)。
(4)氧化损伤检测结果提示抗氧化指标SOD、GSH在NB组及NAC组较H2O2组有显著升高，而MDA水平则下降(P＜0.05，n=15)。
(5)WB检测结果显示，H2O2可升高Akt的磷酸化水平，给予NB处理可进一步增强Akt磷酸化及HO-1表达水平；加入PI3K抑制剂LY294002后，NB对磷酸化Akt的表达则受到抑制。
(6)膜片钳检测显示，在等渗条件下，500μM的H2O2作用10～15分钟能激活VRAC的Cl-电流，而给予NB处理后可以显著抑制H2O2激活的VRACCl-电流(5-6分钟，83.05±3.87%，P＜0.05，n=5)。
结论：NB具有抑制H2O2诱发神经元VRAC氯离子电流的通道阻断作用，稳定细胞内环境，从而发挥神经保护作用；同时，NB通过激活PI3K/Akt信号通路，增加抗氧化酶HO-1的表达，从而提高内源性抗氧化水平减轻H2O2诱导的神经元凋亡性损伤。
第三部分NB对LPS诱导小胶质细胞炎性损伤的作用研究
目的：探讨NB对LPS诱导小胶质细胞炎性损伤的作用及可能的机制。
方法：采用经典致炎诱导剂LPS诱导小胶质细胞N9细胞系模拟缺血再灌注炎症损伤的病理因素，建立体外神经炎性细胞模型。实验分为4组：正常对照组，LPS组，LPS+NB组以及LPS+DCPIB组。采用ELISA法以及RT-PCR检测NB对炎症因子TNF-α、IL-1β释放以及mRNA表达的影响；采用siRNA干扰下调VRAC蛋白LRRC8A，Western-blot技术检测干扰后各LRRC8A的蛋白片段表达情况；并检测下调LRRC8A后各处理组TNF-α、IL-1β的mRNA的水平。
结果：
(1)不同浓度的NB(50、100及200μM)或者联合LPS(1μg/ml)共同作用于N9细胞24h，CCK-8检测显示对小胶质细胞存活率无明显影响。
(2)ELISA法检测显示：与正常对照组相比，LPS组的细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的分泌明显增高(P＜0.05，n=3)，与LPS组相比，NB+LPS组和LPS+DCPIB组的TNF-α、IL-1β的分泌显著降低(P＜0.05，n=3)。
(3)RT-PCR检测显示：与正常对照组相比，LPS能诱导炎性因子TNF-α、IL-1βmRNA的表达显著增高(P＜0.05，n=3)；与LPS组相比，NB组和DCPIB组及siRNA-LRRC8A组的TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平显著降低(P＜0.05，n=3)。
结论：在小胶质细胞炎性损伤过程中，无论是药源NB及DCPIB阻断VRAC，还是siRNA干扰VRAC蛋白LRRC8A，均能够抑制小胶质细胞活化，减少炎性因子TNF-α及IL-1β的释放，提示VRAC参与了LPS诱导的小胶质细胞炎症损伤过程。