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目的与意义：
肺及支气管肿瘤的5年生存率仅为19.4%；近57%的病例在确诊时就已发生转移，而该人群5年生存率为5.2%。因此，肿瘤转移为肺癌预后不良的主要原因之一，研究肿瘤转移机制，对改善肺癌预后具有重要意义。
肿瘤转移的发生可基于一系列侵袭-转移级联反应，而上皮间质转化可促使上皮来源肿瘤细胞获得侵袭、抵制凋亡、播散等有助于细胞转移的能力，从而参与侵袭-转移级联反应的大部分过程，发挥调节肿瘤转移的作用。因此，针对上皮间质转化的研究，有望为揭示肺癌的转移机制提供新的思路。
既往研究提示丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶1(SerineThreonineTyrosineKinase1，STYK1；又称NovelOncogenewithKinasedomain，NOK)对诸多恶性肿瘤的发生发展有促进作用，在肝癌、卵巢癌、胰腺癌中亦发现其与上皮间质转化相关。我科前期研究显示STYK1可提高肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，然而具体机制尚不十分明确，有赖于进一步的深入研究。
叉头转录因子O(ForkheadboxO，FoxO)参与了多条信号转导通路调节，其在决定细胞命运、氧化应激及DNA修复、细胞代谢、免疫调节等方面发挥了重要作用。作为癌症抑制因子，FoxO的作用已趋明了。FoxO的调节机制之一为磷酸化修饰；而STYK1作为受体蛋白酪氨酸激酶超家族成员，可能是通过磷酸化FoxO1而发挥作用。
因此，本实验拟探讨STYK1在非小细胞肺癌转移中的作用及其具体机制，为肺癌转移机制研究提供新的参考，以期为更好地改善肺癌预后提供新的治疗思路。
方法：
一、在临床水平阐明STYK1表达与非小细胞肺癌的相关性。筛选Oncomine数据库数据，对STYK1在非小细胞肺癌中的表达及其与患者预后的关系进行预测；对组织标本进行STYK1蛋白免疫组化染色，分析STYK1表达量与非小细胞肺癌临床病理特征之间的关系，以验证数据库预测结果。此外，对常见肺癌细胞系进行STYK1mRNA及蛋白的检测，分析STYK1在细胞系中的表达情况，并选择相应细胞系进行基因操作研究。
二、细胞水平调控STYK1表达，研究STYK1对肺癌细胞转移相关表型的影响。依据各肺癌细胞系STYK1表达的基线水平，对STYK1低表达的细胞系进行过表达慢病毒转染以上调STYK1表达，而高表达细胞系则予以shRNA质粒转染、下调表达；采用实时无标记细胞分析技术结合Transwell实验，观察不同STYK1表达水平对肺癌细胞系迁移、侵袭能力的影响。同时用蛋白质免疫印迹方法检测STYK1水平变化对上皮间质转化相关标志物表达的影响。
三、构建裸鼠模型，在体探讨STYK1表达与荷瘤动物预后的关系及其对肺癌细胞转移能力的影响。构建肺癌皮下移植瘤及尾静脉转移瘤裸鼠模型，观察STYK1不同表达水平对肿瘤生长、荷瘤裸鼠生存等的关系；同时以荧光素酶标记肺癌细胞，应用活体动物体内可见光成像技术，观察STYK1对肺癌细胞转移的影响。
四、探讨STYK1增强肺癌细胞迁移、侵袭能力及促进上皮间质转化过程的机制。在非小细胞肺癌组织中探讨STYK1蛋白表达与p-FoxO1的关系，并于细胞系中检测STYK1不同表达水平对FoxO1磷酸化修饰的影响。根据FoxO1的磷酸化修饰机制，构建磷酸化位点的FoxO1突变体，并行细胞功能回复实验，明确FoxO1在STYK1增强肺癌细胞迁移、侵袭能力及促进上皮间质转化过程效应中的必要关系。
结果：
一、Oncomine数据库资料预测STYK1的mRNA水平在非小细胞肺癌肿瘤组织中高于正常肺组织，且高表达mRNA与患者术后的不良预后相关。我科肺癌标本库样本STYK1蛋白检测验证了上述预测，且STYK1蛋白高表达更常见于低分化肿瘤、更晚的T、N及临床分期病例，高表达STYK1的患者术后5年生存率更低。此外，STYK1蛋白在常见非小细胞肺癌细胞中的表达亦高于人支气管上皮细胞HBE(human bronchial epithelial cells)。
二、过表达STYK1后，肺癌SW900细胞的迁移、侵袭能力增强；细胞中E-Cadherin表达下降，而Vimentin及上皮间质转化转录调节因子Snail、ZEB2水平升高。与之相反，在Calu-1细胞中下调STYK1表达后，细胞的迁移及侵袭能力减弱，细胞上皮间质转化过程受抑制。
三、体内实验表明，与野生型SW900细胞接种组裸鼠相比，过表达STYK1组裸鼠的瘤体更大、体重较轻、生存时间更短，小动物活体成像结果亦提示过表达组动物中转移瘤病灶数更多、瘤体发出的光子量更多。
四、非小细胞肺癌细胞中STYK1表达量与p-FoxO1/FoxO1值正相关，即STYK1可提高FoxO1磷酸化水平、进而抑制FoxO1功能。细胞功能回复实验示，在SW900细胞中过表达STYK1的同时突变FoxO1磷酸化位点、降低FoxO1磷酸化水平后，原STYK1所介导的SW900细胞迁移及侵袭增强作用及上皮间质转化促进效应受抑制。此外，在非小细胞肺癌肿瘤组织中STYK1蛋白的表达与p-FoxO1表达亦呈正相关关系。
结论：
STYK1在非小细胞肺癌组织及细胞中表达增高，且STYK1高表达与不良预后相关；STYK1高表达可促进非小细胞肺癌的侵袭、转移及上皮间质转化过程，而这种促进作用可能通过升高FoxO1磷酸化水平、进而抑制FoxO1功能所介导。
肺及支气管肿瘤的5年生存率仅为19.4%；近57%的病例在确诊时就已发生转移，而该人群5年生存率为5.2%。因此，肿瘤转移为肺癌预后不良的主要原因之一，研究肿瘤转移机制，对改善肺癌预后具有重要意义。
肿瘤转移的发生可基于一系列侵袭-转移级联反应，而上皮间质转化可促使上皮来源肿瘤细胞获得侵袭、抵制凋亡、播散等有助于细胞转移的能力，从而参与侵袭-转移级联反应的大部分过程，发挥调节肿瘤转移的作用。因此，针对上皮间质转化的研究，有望为揭示肺癌的转移机制提供新的思路。
既往研究提示丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶1(SerineThreonineTyrosineKinase1，STYK1；又称NovelOncogenewithKinasedomain，NOK)对诸多恶性肿瘤的发生发展有促进作用，在肝癌、卵巢癌、胰腺癌中亦发现其与上皮间质转化相关。我科前期研究显示STYK1可提高肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，然而具体机制尚不十分明确，有赖于进一步的深入研究。
叉头转录因子O(ForkheadboxO，FoxO)参与了多条信号转导通路调节，其在决定细胞命运、氧化应激及DNA修复、细胞代谢、免疫调节等方面发挥了重要作用。作为癌症抑制因子，FoxO的作用已趋明了。FoxO的调节机制之一为磷酸化修饰；而STYK1作为受体蛋白酪氨酸激酶超家族成员，可能是通过磷酸化FoxO1而发挥作用。
因此，本实验拟探讨STYK1在非小细胞肺癌转移中的作用及其具体机制，为肺癌转移机制研究提供新的参考，以期为更好地改善肺癌预后提供新的治疗思路。
方法：
一、在临床水平阐明STYK1表达与非小细胞肺癌的相关性。筛选Oncomine数据库数据，对STYK1在非小细胞肺癌中的表达及其与患者预后的关系进行预测；对组织标本进行STYK1蛋白免疫组化染色，分析STYK1表达量与非小细胞肺癌临床病理特征之间的关系，以验证数据库预测结果。此外，对常见肺癌细胞系进行STYK1mRNA及蛋白的检测，分析STYK1在细胞系中的表达情况，并选择相应细胞系进行基因操作研究。
二、细胞水平调控STYK1表达，研究STYK1对肺癌细胞转移相关表型的影响。依据各肺癌细胞系STYK1表达的基线水平，对STYK1低表达的细胞系进行过表达慢病毒转染以上调STYK1表达，而高表达细胞系则予以shRNA质粒转染、下调表达；采用实时无标记细胞分析技术结合Transwell实验，观察不同STYK1表达水平对肺癌细胞系迁移、侵袭能力的影响。同时用蛋白质免疫印迹方法检测STYK1水平变化对上皮间质转化相关标志物表达的影响。
三、构建裸鼠模型，在体探讨STYK1表达与荷瘤动物预后的关系及其对肺癌细胞转移能力的影响。构建肺癌皮下移植瘤及尾静脉转移瘤裸鼠模型，观察STYK1不同表达水平对肿瘤生长、荷瘤裸鼠生存等的关系；同时以荧光素酶标记肺癌细胞，应用活体动物体内可见光成像技术，观察STYK1对肺癌细胞转移的影响。
四、探讨STYK1增强肺癌细胞迁移、侵袭能力及促进上皮间质转化过程的机制。在非小细胞肺癌组织中探讨STYK1蛋白表达与p-FoxO1的关系，并于细胞系中检测STYK1不同表达水平对FoxO1磷酸化修饰的影响。根据FoxO1的磷酸化修饰机制，构建磷酸化位点的FoxO1突变体，并行细胞功能回复实验，明确FoxO1在STYK1增强肺癌细胞迁移、侵袭能力及促进上皮间质转化过程效应中的必要关系。
结果：
一、Oncomine数据库资料预测STYK1的mRNA水平在非小细胞肺癌肿瘤组织中高于正常肺组织，且高表达mRNA与患者术后的不良预后相关。我科肺癌标本库样本STYK1蛋白检测验证了上述预测，且STYK1蛋白高表达更常见于低分化肿瘤、更晚的T、N及临床分期病例，高表达STYK1的患者术后5年生存率更低。此外，STYK1蛋白在常见非小细胞肺癌细胞中的表达亦高于人支气管上皮细胞HBE(human bronchial epithelial cells)。
二、过表达STYK1后，肺癌SW900细胞的迁移、侵袭能力增强；细胞中E-Cadherin表达下降，而Vimentin及上皮间质转化转录调节因子Snail、ZEB2水平升高。与之相反，在Calu-1细胞中下调STYK1表达后，细胞的迁移及侵袭能力减弱，细胞上皮间质转化过程受抑制。
三、体内实验表明，与野生型SW900细胞接种组裸鼠相比，过表达STYK1组裸鼠的瘤体更大、体重较轻、生存时间更短，小动物活体成像结果亦提示过表达组动物中转移瘤病灶数更多、瘤体发出的光子量更多。
四、非小细胞肺癌细胞中STYK1表达量与p-FoxO1/FoxO1值正相关，即STYK1可提高FoxO1磷酸化水平、进而抑制FoxO1功能。细胞功能回复实验示，在SW900细胞中过表达STYK1的同时突变FoxO1磷酸化位点、降低FoxO1磷酸化水平后，原STYK1所介导的SW900细胞迁移及侵袭增强作用及上皮间质转化促进效应受抑制。此外，在非小细胞肺癌肿瘤组织中STYK1蛋白的表达与p-FoxO1表达亦呈正相关关系。
结论：
STYK1在非小细胞肺癌组织及细胞中表达增高，且STYK1高表达与不良预后相关；STYK1高表达可促进非小细胞肺癌的侵袭、转移及上皮间质转化过程，而这种促进作用可能通过升高FoxO1磷酸化水平、进而抑制FoxO1功能所介导。