论文部分内容阅读
目的:
1.对毛叶青天葵和青天葵进行生药鉴别研究,为毛叶青天葵提供生药鉴别依据;
2.对毛叶青天葵进行体外抗乙型肝炎病毒药效筛选实验研究;
3.对毛叶青天葵水提部位进行安全性评价(急性毒性试验)。为开发毛叶青天葵新药资源提供实验依据。
方法:
1.采用基原、性状、显微特征、紫外光谱、DNA分子遗传标记技术(RAPD技术)以及化学成分预试等鉴别方法对毛叶青天葵进行生药鉴别;
2.以2.2.15细胞为模型,加入药物培养8d,显微镜下观察细胞形态,结合MTT法确定最大无毒浓度;用酶联免疫法(ELISA法)检测毛叶青天葵各溶剂提取部位对2.2.15细胞分泌的e抗原(HBeAg)和表面抗原(HBsAg)抑制作用;
3.按改良寇氏法预试,观察小鼠24小时内一次灌胃给药后所产生的毒性反应和死亡情况,测出最大耐受量。
结果:
1.显微鉴别:毛叶青天葵表皮上被多列多细胞非腺毛,整毛成锥形,基圆顶尖,由4~6行细胞组成,每行细胞8~16个,尖端处只有1~2个细胞,细胞短柱形,上端较宽;青天葵则无非腺毛。毛叶青天葵叶肉组织分化为栅栏组织与海绵组织;栅栏细胞一层,细胞细长,海绵细胞1~2层;但青天葵叶肉组织未分化。毛叶青天葵叶柄横切面背面突起13个,其内方的维管束亦是13个,叶柄中部维管束一圈,共11个,束较小;而青天葵背面只有7个钝锥形突起,中部维管束仅2个。毛叶青天葵粉末特征有紫红色色素块;青天葵则没有。上述特征可作为两者的生药鉴别依据。
2.紫外光谱鉴别:不同提取液测得的紫外吸收峰数目和位置有区别。 A石油醚提取液:在292nm处毛叶青天葵没有吸收峰,青天葵有吸收峰;B.乙酸乙酯提取液:在378nm处毛叶青天葵没有吸收峰,青天葵有最大吸收峰;C.正丁醇提取液:在272和329nm处毛叶青天葵有吸收峰,青天葵却没有;D.水提取液:毛叶青天葵无任何紫外吸收峰,青天葵则在202nm处有最大吸收峰,另在256nm处还有一较弱吸收峰。紫外光谱特征性强,可将两者鉴别之。
3.化学成分预试:毛叶青天葵全草中可能含有黄酮类、多糖、苷类、三萜类、甾体、挥发油、皂苷、有机酸、氨基酸等成分。
4.RAPD技术鉴别:选用55条随机引物,从中筛选出了27条稳定性好、谱带清晰的引物进行扩增,得到总扩增谱带150条,其中多态带有137条,多态率达91.33%。结果表明:不同的引物扩增片断的数目及其多态性程度不同,利用RAPD技术可以灵敏地检测出种间遗传多样性。例如,引物S66,既对毛叶青天葵和青天葵产生分子量大小均相同的条带,又产生对青天葵特异性的条带,这说明同属不同种植物间有同源性,同时又存在遗传多样性。叉如S2096引物仅对毛叶青天葵产生多态性扩增,出现谱带,而青天葵则无谱带,从而鉴别之。
5.体外抗乙型肝炎病毒:毛叶青天葵石油醚部位最大无毒浓度(TC0)为6.25mg.ml-1,在最大无毒浓度时对2.2.15细胞分泌的HBeAg、HBsAg抑制率分别为31.38%,12.91%;乙酸乙酯部位最大无毒浓度(TC0)为3.13mg.ml-1,对HBeAg、HBsAg抑制率分别为22.84%,5.18%;正丁醇部位最大无毒浓度(TC0)为3.13mg.ml-1,对HBeAg、HBsAg抑制率分别为53.00%,22.15%;水部位最大无毒浓度(TC0)为3.13mg.ml-1,对HBeAg、HBsAg抑制率分别为74.50%,35.28%。毛叶青天葵各溶剂提取部位对HBeAg、HBsAg抗原作用由强到弱的顺序均为:水部位>正丁醇部位>石油醚部位>乙酸乙酯部位。
6.毛叶青天葵水提部位急性毒性试验:小鼠精神状态良好,大便成形,无一小鼠死亡,计算其最大耐受量为30.0g/kg小鼠体重。
结论:
本研究首次①采用化学成分预试和紫外光谱法对毛叶青天葵进行生药鉴别;②采用RAPD技术进行生药鉴别;③以2.2.15细胞为模型,对毛叶青天葵各提取部位进行体外抗乙型肝炎病毒实验研究,并对其水溶性部位进行急性毒性实验;结果表明:紫外光谱法和RAPD技术可作为毛叶青天葵的生药鉴别方法;毛叶青天葵各溶剂提取部位中水提取部位对2.2.15细胞分泌的HBeAg、HBsAg抑制作用最强,抑制率分别为:74.50%和35.28%;小鼠急性毒性试验结果表明其最大耐受量为30.0g/kg小鼠体重,相当于人拟临床用量的120倍,安全性较大。本文提供了毛叶青天葵的生药鉴别方法、药效部位及安全性评价(急性毒性)科学依据,为进一步开发毛叶青天葵药物资源打下了基础。
本论文研究内容经科技查新证实,目前尚未见与上述特点相同的文献报道。