东亚三角涡虫DjPsa基因的鉴定、表达及功能分析

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东亚三角涡虫(Dujesia japonica)是扁形动物门的代表动物,是首次出现两侧对称、三胚层的类群。由于其具有较强的再生能力,可作为一种研究再生的模型生物,在研究动物起源、进化、胚胎发育及再生机理等方面意义重大。嘌呤霉素敏感型氨肽酶(Puromycin-sensitive aminopeptidase,PSA),也称为细胞质丙氨酰肽酶(Cytosol alanyl aminopeptidase,AAP-S),由于其对嘌呤霉素抑制的独特敏感性而得名,属于锌金属肽酶M1家族。它的生理功能涉及正常细胞的蛋白周转、细胞周期调控、MHC-I分子抗原递呈、神经肽的降解、脑功能等多个方面。本文着重研究涡虫DjPsa基因的结构和表达情况,以期揭示涡虫DiPsa基因在发育、再生和整体中发挥的作用,为了解动物再生的机理和调控途径以及体轴的建立等奠定基础;另外,抑菌实验检测了PSA蛋白的活性。  从东亚三角涡虫文库中分离的克隆B106,序列分析表明,该克隆含639bp的最大开放阅读框(ORF),编码一个212氨基酸组成的蛋白质。经BLASTP比对发现,含有锌结合共有基序HEXXH(X)18E,而HEXXH(X)18E序列为锌金属蛋白酶的典型特征,也是氨肽酶M1家族的特征序列。与其他物种PSA有较高的保守性,故命名为DPsa基因。  本文主要是利用整体原位杂交、RT-PCR、RNA干扰等方法进行了基因表达图式和功能研究;整体原位杂交结果显示,该基因主要在成体的中枢神经系统表达;胚胎发育的不同时期均检测到阳性信号,到幼虫期其表达图式与成体涡虫一致;再生过程中,该基因的表达逐渐从胚基向神经系统上转移。RT-PCR结果显示Djpsa基因RNAi后在涡虫的再生过程中表达量有显著变化,并出现了不同的表型。构建DiPsa基因的原核表达载体经IPTG诱导蛋白表达,结果表明重组质粒在E.coli BL21(DE3)中以包涵体的形式高效表达,Western blotting验证了得到的蛋白为PSA重组蛋白;抑菌实验检测了变性的PSA经复性后其酶活性,表明复性后的PSA具有较强的抑菌作用,为进一步研究它的功能、活性提供基础。
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