论文部分内容阅读
深海来源微生物Pseudonocardia antitumoralis SCSIO01299，利用基因组注释获取片段基因功能信息，利用生物信息学软件FramePlot4.0beta和SignalP4.1Server的分析，在基因组中筛选到一条脂肪酶基因、一条酯酶基因，并用软件Primer Premier5为脂肪酶基因设计了两对引物。利用PCR技术对脂肪酶、酯酶基因进行了特异性扩增。将扩增出的基因片段连接到pET-28a(+)质粒上，导入BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。脂肪酶LipaseB5的基因序列含有972个碱基，编码的蛋白具有323个氨基酸残基并与Pseudonocardia sp.HH130629-09中假定脂肪酶有98％的同源性，但是其功能没有被研究。酯酶EST12-7的基因序列含有927个碱基，编码308个氨基酸，表达蛋白质属于脂肪酶家族Ⅰ。通过软件DNAMAN的对比，找到了酶的催化中心Ser-Asp-His三联体结构和保守序列GXSXG，并用软件MEGA6分别构建了脂肪酶和酯酶的进化树。利用镍柱亲和层析的方法，对脂肪酶LipaseB、酯酶EST12-7纯化，SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化效果，得到两条大小与理论相对分子质量一致的条带。 对LipaseB5、EST12-7进行了酶学性质研究，可以得出:LipaseB5最适反应底物为对硝基苯酚癸酸酯(p-NPD)，最适温度为30℃，最适反应pH为7.5。LipaseB5催化p-NPD水解反应的活性达到140.14U/mg，Vmax和Km分别为109.8μmol/min、0.976mM，催化橄榄油的活力为32.0197U/mg。LipaseB5在pH7.5-8.5范围内保持良好的pH稳定性;在10-20℃低温下保持较高的酶活力，在10-40℃内具有温度稳定性。LipaseB5对大部分金属离子有很好的耐受性，低浓度的Li+、Mg2+对该酶活性有促进作用。LipaseB5对高浓度的NaCl有很好的耐受性，在100mM的NaCl存在下，酶活性保持在大约为103％。LipaseB5对多种短链醇类有机溶剂和表面活性剂有很好的耐受性，TritonⅩ-100、Tween-80和Tween-20对lipaseB5酶有激活作用。 EST12-7对对硝基苯酚己酸酯的催化活性最高，EST2-7催化的酶活力284.22U/mg，Km和Vmax分别为0.1106mM和6.63μmol/min，其最适pH为8.0，但在pH8.5的Tris-HCl缓冲溶液中稳定性最好;最适反应温度为20℃，在高于40℃的环境中处理1h后，酶活力显著下降，在20-40℃的范围内，酶活性随温度升高下降明显;2 mmol/L的Ca+、Mg2+能够激活酶的活性，正癸醇可大幅提高酶活性，并且对多种有机溶剂和表面活性剂具有很好的耐受性，表面活性剂Tween-20、Tween-80、TritonⅩ-100对EST12-7活性具有促进作用。 EST12-7可以拆分（±）-2-氯丙酸甲酯得到(R)-氯丙酸甲酯和(S)-2-氯丙酸，优化后最适反应温度为20℃，在pH8.0，0.8M的Tris-HCl缓冲溶液，添加体积系数为2％的正癸醇作为助溶剂反应后得到产物的光学纯度e.e.s＞99％，转化率为49％。表面活性剂Tween-20、Tween-80、TritonⅩ-100可以提高酯酶EST12-7拆分的活性。