论文部分内容阅读
由于牡蛎的贝壳可塑性很强，外部形态常随着其生活环境的不同而发生极大的变化，牡蛎的分类以及种类鉴定中仍有很多的不确定性和争议，这种情况在中国南方近海的牡蛎分类中尤为突出。华南沿海位于亚热带地区，海岸线很长，且海岸栖息地种类多样，牡蛎种类资源十分丰富，分子系统学的发展为牡蛎种类的系统分类和鉴定提供了有力的可靠的工具，本研究以华南近海存在的牡蛎为研究对象，对其进行鉴定和分布研究。香港巨牡蛎(CrassostreaHongkongensis)(Lam和Morton，2003)是这一区域最重要的牡蛎养殖种类，然而至今对这一重要的养殖种质资源的群体遗传结构却知之甚少。随着分子生物学技术的迅速发展，许多分子标记被应用到种质资源的遗传结构研究，本研究对香港巨牡蛎进行了微卫星位点的开发和筛选，并利用它们进行了群体遗传多样性和群体间遗传分化研究。
1.结合牡蛎贝壳形态特征，使用线粒体DNA16SrRNA和COI两个基因片段对华南近海牡蛎进行系统的种类鉴定及分布的研究。共鉴定出5个属，11种牡蛎，其中，咬齿牡蛎超种Saccostreamordar-C类型为首次报道，巨蛎属的Crassostreasp.可能为新种；分别为，6种巨蛎属(Crassostrea)牡蛎：Crassostreahongkongensis、Crassostreasikamea、Crassostreaariakensis、Crassostreairelalej、Crassostreaangulata和Crassostreasp.；2个小蛎属(Saccostrea)牡蛎超种：僧帽牡蛎(Saccostreacucullata)超种中的S.cucullata-B，S.cucullata-D，S.cucullata-E和S.cucullata-F四种类型，咬齿牡蛎(Saccostreamordax)超种的S.mordax-A，S.mordax-B和S.mordarC三种类型；1种齿蛎属(Dendostrea)牡蛎-缘齿牡蛎(Dendostreacrenulifera)；1种牡蛎属(Ostrea)牡蛎-密鳞牡蛎(Ostreadenselamellosa)，1种舌骨牡蛎属(Parahyotissa)牡蛎-中华牡蛎(Parahyotissasinensis)。并对鉴定出的牡蛎种类进行形态特征和地理分布描述，通过比较19个采用地的牡蛎种类，发现巨蛎属和小蛎属两个属的牡蛎种类不仅种类多，而且在华南近海分布区域广泛。
2.对华南近海存在的七种巨蛎属牡蛎开发了PCR-RFLP鉴定方法。通过种特异性酶切位点的多态性分析，筛选了DdeI+DraI和AluI+MseI两个内切酶组合，适用于对七种巨蛎属牡蛎的16SrRNA基因片段的RFLP鉴定。同时筛选了NisI+AluI和NisI+DdeI两个组合，用于COI基因片段的RFLP鉴定。建立的16SrRNA和COI序列的PCR-RFLP可以完全的区分这7种牡蛎；而对于核基因ITS-1序列，筛选了HinfI和HaeIII两种内切酶，可区分C.hongkongensis、C.sikamea、C.ariakensis、C.irelalei和Crassostreasp.，另外两种酶Fnu4HI和HpyCHIll分别用来鉴别C.hongkongensis和C.ariakensis，C.iredalei和Crassostreasp.两组形态极似的牡蛎，建立的ITS-1PCR-RFLP方法除对Crassostreagigas和G.angulato两种牡蛎不能区分外，对其它5种牡蛎都能区分。
3.对香港巨牡蛎(C.hongkongensis)通过磁珠杂交富集法，开发和筛选了14个微卫星标记。使用4种探针构建微卫星序列富集文库，而后用PCR方法筛选阳性克隆，富集效率达到14.5％。对有完整侧翼序列的微卫星序列设计引物，并对引物进行优化和筛选，得到14个多态性较高的微卫星位点。并对这14个位点进行遗传学参数的估算。
4.采用5个本研究开发的微卫星位点对北海、湛江、珠海和海口的4个地理群体进行遗传多样性和遗传分化分析。结果显示，四个群体平均的等位基因数分别为7.6、7.6、7.2和7.4，平均的观测杂合度分别为0.5166、0.5017、0.4833和0.6042，平均的期待杂合度分别为0.7123、0.6518、0.6940和0.6042，表明采样的4个群体均显示出中等偏高的遗传多样性。但群体间总的遗传分化不显著，雷州半岛对香港巨牡蛎浮游期的迁移可能具有一定的地理阻隔作用。
这些研究为进一步掌握和认识华南近海牡蛎的种类和分布情况提供了指导和借鉴，为本地牡蛎种类生物多样性保护提供了重要参考和依据。对华南沿海7种巨蛎属牡蛎开发快速和有效的PCR-RFLP鉴定方法，可用于种质资源的管理，牡蛎种质和幼苗的鉴定以及对该地区可能存在的新的巨蛎属牡蛎种类的检测。对香港巨牡蛎开发微卫星并评估不同地理群体的遗传多样性和遗传分化，为香港巨牡蛎的种质资源管理与保护提供可靠的群体遗传学数据和决策理论依据。