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米曲霉（Aspergillus oyzae）能够分泌高活力的酶，因而被长时间应用在传统发酵食品的生产中。米曲霉中性蛋白酶（neutral protease）的分解作用将原料中的蛋白质发酵水解成多种氨基酸。本研究以米曲霉中性蛋白酶I(NPI)作为对象，分析糖基化对蛋白酶活力的影响，并进一步构建食品级高活力的中性蛋白酶基因米曲霉工程菌。主要研究内容如下： 1对中性蛋白酶进行三维结构模拟，分析发生突变的位置，发现糖基化位点都发生在蛋白酶表面。利用定点突变技术获得了表达载体pPIC9K-NPI-P56Y-6His和pPIC9K-NPI-N41AP56Y-6His，转入毕赤酵母Gs115。利用BMGY/BMMY培养基诱导蛋白表达，分别在60 h和72 h达到最大酶活42U/mL和60U/mL。对表达的蛋白酶进行硫酸铵沉淀和镍柱纯化，SDS-PAGE分析得蛋白分子量大小分别为70 KDa和50 KDa左右。对中性蛋白酶的活力进行测定：rNPI的酶活为217 U/mg，rNPI-P56Y的酶活为242 U/mg，rNPI-N41AP56Y的酶活为147 U/mg。 2以尿嘧啶依赖的米曲霉工程菌AS11为出发菌株，以0.8M NaCl溶液作为渗透压缓冲液制备米曲霉原生质体，原生质体浓度达到8.5×106个/mL，再生率为22％。构建了打靶载体 pNP-NPI-6His、pNP-NPI-Y122FK246ID382V-6His和pNP-NPI-Y122FK246ID382VY186S-6His。转化米曲霉原生质体。三株转化子分别命名为：米曲霉D（ pNP-NPI-6His）、米曲霉 E（pNP-NPI-Y122FK246ID382V-6His）和米曲霉F（pNP-NPI-Y122FK246ID382V-Y186S-6His）。米曲霉 AS11的酶活为3100.36 U/g；米曲霉B的酶活为2290.81 U/g；米曲霉D、E、F的酶活分别为3978.41 U/g、4435.62 U/g和3540.27 U/g。