磁性纳米材料基固定化微酶反应器的制备与应用

来源 :华东理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangying428
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在蛋白质鉴定中,对蛋白进行快速酶解是完成质谱鉴定的重要环节,发展快速有效的酶解方法对于蛋白质的快速、准确鉴定具有重要意义。本文基于亲水性聚合物修饰的磁性纳米材料制备了两种单酶反应器和两种双酶反应器,并将其用于蛋白质组学研究。  以聚丙烯酸修饰的磁性纳米材料为载体,通过共价键合法将胰蛋白酶固定到载体上制备胰蛋白酶单酶反应器。制备的酶反应器具有良好的重复性和稳定性。三种标准蛋白(牛血清白蛋白、肌红蛋白、细胞色素C)氨基酸序列覆盖度和匹配的肽段数分别为56.7±2.5%(33条)、86.0±3.8%(13条)、81.7±2.7%(16条),酶解效果与24h自由溶液相当,而酶解时间缩短到10 min。以共价键合法将糜蛋白酶键合到聚丙烯酸修饰的纳米材料上,同样具有良好的酶解重复性和长期使用稳定性。  将制备的糜蛋白酶反应器与胰蛋白酶反应器串联使用制备两种双酶反应器(TCR和CTR),极大地增加了检测到的肽段数和氨基酸序列覆盖度。以牛血清白蛋白为模型样品对双酶反应器的酶解性能进行评价。结果表明当两种酶含量比为1∶1时具有最佳的酶解效果。以碳酸酐酶为样品对制备的双酶反应器的重复性和稳定性进行考察,两种双酶反应器均具有良好的稳定性和重复性。结合以上两种双酶反应器和自由溶液双酶酶解(TCR、CTR、TC)酶解鼠肝蛋白样品,结果显示TCR和CTR均具有良好的酶解效果,三种酶解方式一共可以鉴定到1544种蛋白,9639条肽段。  以共价键合法和铜离子螯合法将胰蛋白酶分别固定到聚甲基丙烯酸修饰的纳米材料以及支链状亲水性聚合物聚乙烯亚胺修饰的纳米材料上制备胰蛋白酶反应器(EBR-1和EBR-2)。以三种标准蛋白对酶解性能进行评价,EBR-2的酶解性能优于24h自由溶液酶解和EBR-1,说明支链状亲水性聚合物的修饰提高了固酶量及载体的亲水性,显著提高酶解性能。将EBR-2应用于鼠肝蛋白分析,鉴定出582种蛋白,1744条肽段,而24 h自由溶液酶解仅鉴定到496种蛋白,1693条肽段。
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