广东省swHEV的流行病学调查及检测平台的建立

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戊型肝炎是由戊型肝炎病毒引起的一种传染性疾病,已引起亚洲和非洲的许多发展中国家爆发急性肝炎。HEV主要经粪口途径传播。越来越多的证据表明,戊型肝炎是一种人兽共患病,并且猪是HEV的重要宿主。1997年美国学者从猪体内分离出1株野生型HEV,发现其与人类的HEV有极高的同源性。随后的研究发现与猪密切接触的职业人群(如兽医、养殖员等)对HEV有更高的感染风险。而且在日本更有食用未煮熟猪肉而感染HEV的报道。HEV在猪群中广泛存在,引起了人们对人兽共患病和食品安全产生的公共卫生问题的关注。  本研究采用双抗原夹心ELISA检测2009-2011年间采自广东省各地区的若干个猪场的484份血清样品进行血清流行病学调查,同时对69份病猪胆汁样品进行分子流行病学调查,基于ORF2部分基因序列进行核苷酸序列比对、相似性分析和遗传进化树分析。结果显示,全部被检查猪的swHEV抗体平均阳性率为71.9%(348/484),分离的猪源HEV毒株均属于基因Ⅳ型,阳性率为71.0%(49/69)。上述数据表明基因Ⅳ型swHEV在广东地区普遍流行。  本研究根据GenBank中猪戊型肝炎病毒的ORF2核苷酸序列的保守区域设计合成一对特异性引物,建立了一套SYBR Green I荧光定量PCR检测swHEV的方法,并评价了该方法的灵敏度、稳定性和特异性,同时与常规的RT-nPCR进行对比分析。结果表明,建立标准曲线的相关系数为0.998,斜率为-3.039,Ct值变异系数(CV)在0.17%~1.41%之间,有良好的稳定性。同时在检测猪群常见病中显示出很好的特异性,并且比RT-nPCR更灵敏,适合于swHEV的检测。  本研究根据ORF3基因的保守区域设计了一套引物,建立了检测swHEV的一步法RT-LAMP。该方法可以检测到10个拷贝数的RNA模板,比RT-nPCR灵敏10倍。在检测猪常见病毒中,RT-LAMP方法也显示出很强的特异性。分别用RT-LAMP和RT-nPCR检测41份胆汁样品,RT-LAMP检测出36份阳性,而RT-nPCR检测出18份阳性,进一步说明RT-LAMP比RT-nPCR有更高的灵敏度。本研究建立的RT-LAMP检测方法不但可以应用于swHEV的实验室检测,还可以推广到现场诊断中。  本研究创新的用HepG2-ORF3稳定细胞系建立了检测swHEV抗体的IPMA方法。该方法操作简单,重复性好,并且在检测猪血清常见病毒抗体中显示出良好的特异性。分别用IPMA和ELISA随机抽检141份猪血清,IPMA检测出127份阳性,14份阴性;ELISA检测出124份阳性,17份阴性。IPMA与ELISA的总符合率为92.2%,表明该方法适合swHEV抗体的检测,并可在临床诊断中推广。
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