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日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)可经蚊虫传播引起严重的人畜共患疾病。JEV属于黄病毒科黄病毒属家族,其基因组只有一个开放阅读框,可编码3个结构蛋白,衣壳蛋白(C),膜蛋白(M),囊膜糖蛋白(E)和7个非结构蛋白(NS1,NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5)。本研究中,(1)分析了JEV感染细胞不同时间点脂肪酸合成途径中相关酶类mRNA水平上的变化；(2)选择针对乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)和脂肪酸合成酶(FAS)的抑制剂,对其抑制JEV感染活性进行研究,结果证明这两个酶在病毒感染过程中具有重要作用；(3)针对宿主细胞DEAD-boxRNA解旋酶DDX3的抑制剂抑制JEV感染的活性研究,筛选得到3个能够抑制病毒感染的化合物。主要研究内容分为以下4个部分：1.JEV感染对宿主细胞内脂肪酸生物合成过程中相关酶的影响设计针对13个宿主细胞脂肪酸生物合成过程相关酶/蛋白的实时荧光定量PCR引物,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)作为内参。收集感染病毒12、24和48 h的细胞,通过实时定量PCR方法检测脂肪酸合成相关酶/蛋白在mRNA水平上的变化。结果表明与脂肪酸生物合成相关的13种酶类在病毒感染后的不同时间点mRNA水平都发生了相应的变化,其中,与未接毒的细胞相比,ACC1的ml RNA水平一直下降,FAS先升高后下降,说明JEV感染细胞后影响了脂肪酸生物合成过程。2.体外下调脂肪酸生物合成途径而抑制JEV的感染利用ACC1酶活抑制剂(TOFA)和FAS酶活抑制剂(C75)分3种不同方式处理细胞,通过噬斑、实时定量PCR和Western blot试验证明脂肪酸生物合成在JEV感染过程中起重要作用。体外细胞试验结果表明当抑制剂预处理并在感染过程中持续存在时,其抗病毒效果最好。另外,激光共聚焦试验显示病毒感染细胞时FAS与JEV NS3和NS5蛋白共定位,并且与病毒RNA部分共定位,说明FAS可能与JEV的复制相关。试验结果表明,FAS和ACC1在日本脑炎病毒感染过程中起着重要作用。3.体内下调脂肪酸生物合成途径而抑制JEV的感染应用ACC1抑制剂(TOFA)和FAS酶活抑制剂(C75、EGCG)分别处理小鼠。将50只小鼠随机分为TOFA、C75、TOFA 和 C75、PBS阴性对照组和病毒接种组5个组；将另30只小鼠随机分为EGCG、PBS阴性对照组和病毒接种组3个组。观察小鼠21 d,记录小鼠的发病特征和死亡情况,统计小鼠的存活率。试验结果表明抑制剂可提高小鼠在致死剂量JEV攻毒下的成活率,说明体内抑制脂肪酸合成途径可以降低JEV的感染率。4.宿主蛋白DEAD-box (DDX) RNA解旋酶—DDX3酶活抑制剂体外抗JEV感染的研究本研究对6种DDX3酶活抑制剂(BA06、BA24、BA126、BA333、BA329、BA333、 BA335)抑制日本脑炎病毒感染的效果进行了研究。通过噬斑实验筛选出抑制JEV感染效果较好的抑制剂,并进行剂量依赖性试验研究,计算其半数抑制浓度。本试验结果筛选出3种在体外具有较好抗JEV活性的DDX3酶活抑制剂(BA126、BA333、 BA335),且抑制病毒感染具有剂量依赖性。