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目的： 建立施杞教授治疗颈椎病患者的数据库和“施氏通痹12方”交互信息表，利用数据挖掘技术对施氏临证处方时的用药规律和“施氏通痹12方”的药对配伍关系进行统计分析。深入研究核心药对的药物有效组分在体内的代谢成分，利用体外细胞和椎间盘3D细胞培养技术，研究其配伍协同的机制。 方法： 1.建立施杞教授治疗颈椎病患者的数据库，利用关联规则分析用药规律 将2000年至2005年跟随施杞教授门诊抄方的记录信息录入Excel软件，提取其中颈椎病病例分型和用药信息，建立颈椎病临床信息数据库，利用数据挖掘技术对颈椎病分型和用药频次分布统计，并对二者进行置信度、支持度和提升度分析，研究关联规律、各分型的组方规律以及常用药对和核心方的配合规律。 2.建立“施氏通痹12方”交互信息表，利用复杂网络技术分析配伍机制 将“施氏通痹12方”药物信息录入Excel软件，12方的方名为行(formula_1-12)和中药名为列(herb_1-72)统一编号后，药物按君臣佐使分层三重权重(三重权重：第一重权重君臣佐使四层次权重；第二重权重君臣佐使四层内权重；第三重权层内药对权重)，建立交互信息表。利用复杂网络的数据挖掘技术、Metlab软件运算联合使用互信息关联度、联合概率和中心度算法，计算12方中的药物配伍信息，NetDraw软件绘图显示结果。 3.“施氏通痹12方”核心药对在体内代谢成分的追踪及其细胞分子水平作用机制研究 综合利用液质联用、气相色谱和中药药理血清学技术，追踪“芪麝丸”的有效组份，确定和分离发挥主要作用的单体。模拟体内炎症损伤的过程，建立体外IL-1诱导的软骨细胞炎症损伤模型，研究软骨细胞内钙离子在炎症损伤时的变化规律。采用有效单体和不同配伍组合干预细胞模型，观察软骨细胞钙离子浓度的变化规律，分析协同配伍机制。实时定量RT-PCR分析软骨细胞外基质的特征性成分胶原、蛋白多糖以及代谢相关酶和细胞因子的基因表达情况，并观察中药单体和复方干预的效果。 4.“施氏通痹12方”核心药对单体对体外3D培养的椎间盘力学因子和细胞外基质代谢的影响 利用体视学解剖技术摘取6周龄C57小鼠的尾部椎间盘，培养于3D琼脂糖胶内，模拟生理状态的力学应力刺激和病理状态炎性因子诱导体外培养的椎间盘，建立IL-1β诱导的椎间盘器官退变模型。制作冰冻切片和藏红固绿染色观察椎间盘结构的形态学，检索MGF序列设计引物和探针，利用PCR和原位杂交技术检测MGF的表达，分析椎间盘细胞外基质代谢相关基因的表达情况，在此基础上利用IL-1β诱导椎间盘退变，观察中药单体和复方干预的效果。 结果： 1.301例颈椎病患者中，男性103例34.22％，女性198例65.78％，平均年龄52.83±12.49(最大年龄90岁，最小年龄22岁)。其中颈型1例、神经根型113例、脊髓型45例、椎动脉型63例、交感型18例、混合型61例。全部治疗过程共使用中药181味，用药总频次5269次，每方平均17.5味药(最大处方22味，最小处方13味)。常用药对的关联规则运算结果中，气血类中黄芪→当归的支持度最高86.05％，黄芪→川芎的提升度最高1.2。其余常用药对，气血类丹参→党参和党参→当归；理气类药对如枳壳→柴胡，置信度96％和支持度5.78。化瘀类药对；红花→桃仁，三棱→莪术。专用的药对组合：天麻→钩藤、半夏→天麻、茯神→茯苓、香附→当归、乳香→鸡血藤、青风藤→鸡血藤；虫类药对：全蝎→蜈蚣。 2.“施氏通痹12方”共使用中药72味，每方平均15味药。从用药频次来分析，君药频次最高排前三位；臣药排在其后；使药常用牛膝和炙甘草；佐药频次低，分布广，变化多。根据中医君臣佐使组方的原则，利用君臣佐使三重权重方法成功的建立了“施氏通痹12方”的交互信息表，在此基础上利用复杂网络DMIM2和SCORE公式运算了12方交互信息表中的数据，绘制的热点图上药对越重要，颜色越红。根据结果绘制的网络关系图上，可视化的表达了核心药对与其他药对的相关性，符合临床实际用药情况。 3.“芪麝丸”代谢成分的追踪发现血清中含有多个君药对黄芪和川芎的单体成分，其中阿魏酸的含量最高；经过条件优化IL-1β诱导C5.18细胞胞内钙离子浓度最佳组合是10ng/ml，5min；中药单体川芎嗪、黄芪甲苷和阿魏酸不能够刺激胞内钙离子浓度升高，而麝香酮有刺激胞内钙离子浓度升高的作用：使用单体拮抗IL-1β诱导时，川芎嗪和黄芪甲苷在中浓度时有一定的钙离子拮抗能力，降低有效浓度的复方1和复方4仍起到拮抗效果，表明组合有协同作用；体外干预结果，IL-1β诱导后胶原表达调，蛋白多糖表达受抑制，基质代谢酶表达升高，炎症因子表达升高。川芎嗪和黄芪甲苷单独干预后，逆转升高蛋白多糖，抑制基质代谢酶表达，复方干预后，逆转升高蛋白多糖，抑制蛋白多糖酶表达，下调炎症因子表达，复方4还升高了MGF表达。 4.干细胞分化为成骨细胞后MGF表达增高，分化为脂肪细胞后则相反。体外3D培养的椎间盘连续观察12天以上生长良好，细胞无迁出。正常对照组MGF原位杂交染色结果可见，正常椎间盘内的纤维环、软骨终板和髓核内的细胞均有阳性染色，其中髓核细胞的阳性染色最强烈，提示椎间盘表达MGF的主要部位在髓核内。力学刺激后结果可见，椎间盘三大结构的阳性染色有增强。PCR实验也发现力学刺激椎间盘后MGF表达升高。形态学观察发现IL-1β诱导后椎间盘纤维环排列不齐，结构疏松，软骨终板空隙增加，髓核着色力下降。川芎嗪组软骨终板空隙有改善，但纤维环结构疏松，髓核着色力仍不强。黄芪甲苷组纤维环结构紧密，软骨细胞着色力明显增强。复方1组，纤维环结构紧密，髓核内部着色力增强。复方4组，纤维环结构紧密，内部软骨细胞着色力强，髓核深染明显。PCR实验结果验证了细胞学实验结果，IL-1β诱导后椎间盘相关炎症因子表达升高协同刺激胶原表达增生，蛋白多糖合成下降，基质代谢酶分泌增多，导致细胞外基质代谢失衡。中药单体川芎嗪和黄芪甲苷对蛋白多糖表达有促进作用，并可抑制蛋白多糖酶表达。复方1和复方4可增强蛋白多糖的表达，复方4对蛋白多糖酶表达有下调作用，二者可逆转TNF-α的表达上升，对生长因子IGF-1Ea(IGF-1)表达影响不明显，但是对力生长因子IGF-1Eb(MGF)有明显的上调作用，器官水平实验结果与细胞学实验结果基本一致。 结论： 1.施杞教授临床治疗颈椎病，药对多，用药精，组方层次分明。301个颈椎病医案总共只使用了181味药，处方中多个药对组合，以黄芪、川芎和当归药对组成君药核心，其他气血药对为臣，佐以理气药对、化瘀药对和虫类药对。数据挖掘技术对名老中医档案，解析其中的规律，分析名老中医个体临床经验，实现名医经验的有效总结与传承的有利工具。 2.“施氏通痹12方”用药精：只使用了72味药，平均每方15味药；组方层次分明：按君臣佐使原则组方；药对多，黄芪→川芎是核心药对，是12方的君药。君臣佐使三重权重法很好的实现了12方君臣佐使的组方过程，最大程度的保留了12方内的药物关系的信息。中医君臣佐使的辨证思维可以很好的通过分层和权重来数据化的模拟，本研究对中医君臣佐使理论的数据化和网络化实践，做出了新的尝试。复杂网络的数据挖掘技术是研究中医辨证思维的有利工具，利用它来总结和传承名老中医学术经验，要因人制宜，灵活运用，才能更加符合临床实验。 3.建立了IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型，实验结果表明IL-1β诱导后胞内钙离子浓度升高，并可引起一系列基因表达调控，相关炎症因子表达升高协同刺激胶原表达增生，蛋白多糖合成下降，基质代谢酶分泌增多，导致细胞外基质代谢失衡。12方核心药对黄芪和川芎的主要活性成分，川芎嗪和黄芪甲苷在一定浓度时可拮抗IL-1β的致炎作用，1/2或1/3有效剂量的复方组合仍然可发挥这种抗炎效果，实验结果表明复方作用指标更全面，效果更稳定，体现了单体组合的协同作用。 4.建立了体外3D培养的椎间盘器官模型，以成骨细胞为参照，验证了该模型具有力学响应的特性。髓核MGF阳性最强，表明椎间盘的力学感应中心的在髓核。建立了IL-1β诱导的椎间盘体外退变模型，在此基础上验证了中药单体和复方组合的有效性和探索了作用机制。体外3D培养椎间盘在炎症因子的诱导下，协同相关的炎症因子共同调节细胞外基质胶原增生，蛋白多糖成分含量下降，诱导基质代谢酶分泌，从而破坏细胞外基质的代谢平衡。中药单体和复方组合通过抑制炎性因子表达，调节细胞外基质胶原和蛋白多糖表达，抑制基质代谢酶的升高，从而稳定细胞外基质的代谢平衡。综合以上结果表明中药单体和复方组合的抗炎效果明显，复方4影响的指标最多，并对力生长因子有一定的促进表达作用，而且结果一致性最高，体现了核心药对的协同机制。