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背景胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一,发病率居我国各类肿瘤发生前列,因此,胃癌的早期诊断与治疗对于其预后显得十分必要。胃癌的发生是一个多因素、多步骤的慢性渐进过程,主要的致病因素包括环境、饮食、遗传、幽门螺杆菌感染、慢性炎症浸润、癌前病变等。其中,幽门螺杆菌( Helicobacter pylori, H. pylori)在世界范围内感染广泛,与胃炎、消化性溃疡乃至胃癌发生密切相关,1994年由WHO正式列为Ⅰ类致癌因子。目前,多数研究显示在由慢性胃炎、胃粘膜溃疡/萎缩、肠化生、异型增生直至胃癌的演变过程中,H. pylori可能起先导作用,为胃癌发生的一个始动因素。但是,目前胃癌的发病机制尚未完全阐明。miRNAs(microRNA,微小RNA)是一类在转录后水平或翻译水平调控基因表达的小的内源性非编码RNA分子,约长17-27nt,在细胞与组织中特异表达。miRNAs通常与靶基因3’UTR区结合,调控生长发育、细胞分化、增殖、凋亡及肿瘤发生等。已经证实大量miRNAs在癌细胞及癌组织中异常表达,某些miRNAs影响胃癌的发生、发展及预后等,然而miRNAs与胃癌发生的具体作用机制仍有待于进一步研究。本课题组利用miRNAs芯片检测H. pylori感染胃上皮细胞前后miRNAs表达谱的变化结果,发现miR-30b(hsa-mir-30b)在H. pylori感染的胃上皮细胞中明显上调,并且有报道证实其与肺癌、膀胱癌、甲状腺瘤、髓母细胞瘤和恶性间皮瘤等各种肿瘤的发生密切相关,但miR-30b在胃癌中的作用鲜有研究。因此本课题选定H. pylori感染相关的miR-30b为研究对象,对其在胃癌发生中的功能进行探索。目的本研究通过realtime PCR(实时定量PCR)技术对miRNAs芯片结果进行验证,深入检测在H. pylori感染不同胃癌细胞株前后,正常胃粘膜/胃癌,正常胃粘膜/不同胃癌细胞株情况下miR-30b的表达差异;通过过表达或抑制miR-30b表达,评价miR-30b对胃癌细胞株在增殖、凋亡、致瘤能力方面的影响;最后鉴定miR-30b的靶基因,并检测靶基因与miR-30b在不同胃癌细胞株和胃癌组织中的表达水平及相关性,探索miR-30b参与胃癌发生的分子作用机制。方法1. miR-30b在H. pylori感染胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达分析。通过northern blot和realtime PCR技术,检测miR-30b在H. pylori感染不同胃癌细胞株前后、正常胃粘膜/胃癌、正常胃粘膜/不同胃癌细胞株中的表达水平。2.体内外分析miR-30b对胃癌细胞增殖、凋亡、致瘤特性的影响。胃癌细胞株转染miR-30b mimics或inhibitors后,在体外,通过CCK-8检测miR-30b对胃癌细胞株增殖的影响;使用Annexin V-FITC/PI对肿瘤细胞双染后通过流式细胞检测术检测以及通过caspase-3/7活性检测确定miR-30b对胃癌细胞株凋亡的影响;在体内,通过裸鼠荷瘤模型和原位Tunel实验检测miR-30b对胃癌细胞株致瘤性的影响。3.预测、鉴定miR-30b的靶基因,检测靶基因与miR-30b在不同胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达水平及相关性。首先用miRNAs靶基因预测数据库TargetScan、Miranda、PicTar预测miR-30b的靶基因,然后构建靶基因报告载体,利用荧光素酶报告系统、GFP荧光抑制分析、Western blot技术鉴定之;利用realtime PCR和Western blot,检测靶基因与miR-30b在不同胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达水平及相关性。结果1. miR-30b在H. pylori感染胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达分析通过realtime PCR检测,H. pylori在感染胃上皮细胞GES-1、胃癌细胞株AGS、HGC-27、SGC-7901 9h后miR-30b表达升高,不同胃癌细胞株较正常胃粘膜miR-30b表达下降;通过northern blot和realtime PCR检测,与正常胃粘膜相比,胃癌组织样本中miR-30b表达下降。2.体内外分析miR-30b对胃癌细胞增殖、凋亡、致瘤特性的影响在体外,发现miR-30b可以促进胃癌细胞株AGS、HGC-27、SGC-7901细胞的增殖,抑制胃癌细胞株SGC-7901细胞的凋亡;在体内,miR-30b可以通过促进胃癌细胞株SGC-7901细胞的凋亡,而抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。3.预测、鉴定miR-30b的靶基因,检测靶基因与miR-30b在不同胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达水平及相关性。用miRNAs靶基因预测数据库TargetScan、Miranda、PicTar同时预测得miR-30b的靶基因TP53INP1和PAI-1;构建包含靶基因3’UTR作用靶点的荧光素酶报告载体及GFP报告载体,证实miR-30b能与靶基因3′-UTR结合; Western blot结果表明,miR-30b可抑制靶基因蛋白水平表达,说明TP53INP1及PAI-1为miR-30b的靶基因。通过realtime PCR、Western blot检测TP53INP1、PAI-1和miR-30b在不同胃癌细胞株中表达呈负相关;通过realtime PCR检测PAI-1和miR-30b在胃癌组织样本中表达呈显著负相关(R= - 0.6475,P=0.0123)。结论1.通过H. pylori感染胃上皮细胞株前后miR-30b的表达检测,验证了先前的miRNAs芯片检测结果。H. pylori感染导致胃上皮细胞株及不同胃癌细胞株中miR-30b表达升高,在体外,过表达miR-30b促进胃癌细胞株增殖,抑制其凋亡,提示机体可能以这种方式减缓了在H. pylori感染早期所诱导的胃上皮细胞的过度凋亡进程,从而发挥了相应的保护作用。2.相对于正常胃粘膜组织,在不同胃癌细胞株及胃癌组织样本中miR-30b都表达下调。在体内,过表达miR-30b后,促进了皮下肿瘤细胞的凋亡,同时裸鼠的皮下肿瘤生长被抑制,暗示在胃癌的发生发展过程中miR-30b可能作为一个抑癌基因而被抑制。3. miR-30b的靶基因中既包括抑癌基因如TP53INP1,也包括癌基因如PAI-1,暗示在H. pylori感染早期到最终胃癌的发生过程中,miR-30b可能发挥了不同的作用。由此,提示miR-30b可以作为胃癌诊断或治疗的靶点,同时也说明在针对单一基因或其表达产物设计检测手段或治疗药物时应充分考虑到基因参与生命活动的复杂性。