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目的：建立分辨率高和重复性好的正常大鼠、二甲基亚硝胺诱导肝硬化大鼠及中药治疗后大鼠肝组织的双向凝胶图谱,识别与鉴定其差异表达的蛋白质,寻找肝硬化发生发展及中药起效的相关蛋白质。
方法：采用二甲基亚硝胺诱导大鼠肝硬化模型,从第5周开始应用不同功效经典方剂(清热利湿的茵陈蒿汤、益气的黄芪汤、养阴的一贯煎、活血化瘀的下瘀血汤,并设对照组和解少阳的小柴胡汤)进行治疗。造模结束后,利用固相pH梯度双向凝胶电泳方法,分离正常、模型及药物治疗后大鼠肝组织的总蛋白,凝胶经银染显色后,采用ImageMaster 2D Platinum 6.0图像分析软件对扫描后的凝胶图谱进行分析。选取部分分辨率较好的差异蛋白质点进行原位胰蛋白酶酶解,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)测定其胶内酶解后的肽质量指纹图谱,经数据库查询,初步鉴定出差异表达的蛋白质。最后应用酶活性检测法和Western blot法对初步鉴定出的蛋白进行验证。
结果：
1.得到了分辨率高及重复性好的正常、模型及药物治疗后大鼠的肝组织双向凝胶图谱。经斑点检测、匹配、背景扣除和归一化处理,检测到950-1650个蛋白点。
2.从6周正常组大鼠肝组织凝胶图谱选取1片分辨率较高的作为参考胶,模型组、茵陈蒿汤组、黄芪汤组、一贯煎组、下瘀血汤组与之相比较,蛋白质斑点匹配率分别为59.29％、48.42％、68.52％、55.3％和42.05％,匹配点数分别为471、446、831、721、657个。
3.从正常组和模型组中共筛选出32个差异表达蛋白质点(正常组高表达者15个,模型组高表达者17个)做MALDI-TOF/TOF-MS鉴定,初步鉴定出29个蛋白质,其中模型组中表达上调而茵陈蒿汤组表达下调的蛋白有(2216)蛋白二硫化异构酶A3前体、(1714)谷胱甘肽S转移酶mu2、(1300)氨基甲酰化磷酸合成酶1、(1373)醛脱氢酶、(1412)氨基甲酸化磷酸合成酶1、(1446)调钙素、(1663)蛋白二硫化异构酶A3前体、(1681)氨基甲酸化磷酸合成酶1、(1721)α-2u球蛋白、(2015)醛-酮还原酶家族1、(2059)转铁蛋白、(2566)α-2u球蛋白前体、(2688)β2珠蛋白、(2769)过氧化还原蛋白6;其中尤以醛脱氢酶、氨基甲酰化磷酸合成酶1、蛋白二硫化异构酶A3前体、转铁蛋白、β2珠蛋白及过氧化还原蛋白6下调最为显著。模型组表达下调而黄芪汤组表达上调的蛋白有(2500)4-三甲基色氨酸丁醛脱氢酶、(2497)磷脂酰乙醇胺结合蛋白、(2918)过氧化氢酶、(1477)烯醇酶1、(2964)谷胱甘肽S转移酶A5、(819)Aa2-041(BCL-2相关转录因子1)、(2533)热休克蛋白70、(2891)醛缩酶、(2968)肝脏脂肪酸结合蛋白p14等。其中尤以过氧化氢酶、磷脂酰乙醇胺结合蛋白、烯醇酶1、热休克蛋白70、Aa2-041、肝脏脂肪酸结合蛋白p144上调最为显著。通过对这些初步鉴定的蛋白质的功能分析,发现了一些与氧化应激、信号转导、能量代谢等与肝纤维化形成和逆转相关的蛋白质。
4.质谱初步鉴定的蛋白质点(谷胱甘肽S转移酶mu2、过氧化氢酶、调钙素)的验证结果与前期研究结果基本一致。
结论：
1.基于对DMN肝硬化大鼠肝组织蛋白质表达谱中变化较显著的蛋白质鉴定结果认为,内质网应激、过氧化与抗过氧化平衡失调是该模型的重要病理特征。
2.抑制调钙素表达及内质网应激是茵陈蒿汤有效逆转DMN大鼠肝硬化的主要机制之一。
3.提高抗过氧化能力、促进肝脏代谢是黄芪汤逆转DMN大鼠肝硬化的主要作用途径。