扶正化瘀复方抑制肝星状细胞自噬抗肝纤维化的作用机制

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目的:明确扶正化瘀复方抗肝纤维化的作用是否与其抑制自噬有关。  方法:C57小鼠随机分为正常组(N组)和造模组,造模组采用CCl4腹腔注射诱导小鼠肝纤维化模型,1w后随机分组模型组(M组)、雷帕霉素组(Rapa组)、雷帕霉素加氯喹组(Rapa+CQ组)、雷帕霉素加丹参酚酸B组(Rapa+ SA-B组)、雷帕霉素加扶正化瘀组(Rapa+FZ组),每日药物灌胃。5w后处死小鼠, HE和天狼猩红染色分别观察各组肝组织炎症和胶原沉积情况;测定羟脯氨酸含量。Western blot方法和电镜的方法检测肝组织中自噬的表达变化,Western blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ,p62,α-SMA,Alb和Col.Ⅰ的蛋白表达,冰冻切片免疫荧光染色观察各组肝组织o-SMA及LC3B免疫荧光定位。  结果:  1.N组与M组小鼠体重无明显差异,使用Rapa的4组小鼠体重均明显下降。实验各组小鼠的肝体比和脾体比较N组均有明显增加。  2.各组CCl4小鼠较N组胶原增生显著增加,但各Rapa组胶原增生程度较M组减少,但是用Rapa的4组间差异不显著。  3.M组小鼠的肝脏Hyp明显升高。各组使用Rapa的小鼠Hyp含量均较M组减少,其中仅Rapa+FZ组与M组间的差异有明显统计学意义。  4.电镜观察肝组织切片,静止期及活化的HSC中均未找到自噬体,仅在M组肝细胞中观察到自噬小体。  5.M组α-SMA和Col.Ⅰ蛋白的表达均较N组明显增强。Rapa组和Rapa+ SA-B组的α-SMA的表达与M组相似;Rapa+CQ组、Rapa+FZ组较Rapa组有显著降低。Rapa组、Rapa+SA-B组和Rapa+FZ组小鼠的Col.Ⅰ蛋白表达较M组减少,有统计学意义;Rapa+CQ组的Col.Ⅰ蛋白表达明显高于Rapa组。  6.各组模型小鼠肝组织p62的蛋白表达均较N组为低,其中Rapa组和Rapa+SA-B组小鼠的表达下降有统计学意义;Rapa+SA-B组则更低,与Rapa组之间的差异有统计学意义。  7.各组小鼠肝组织免疫荧光染色显示, N组小鼠肝脏内未见LC3B与α-SMA共表达的黄色共染细胞,M组小鼠肝内见到黄染细胞,应用Rapa的4组小鼠黄色共染细胞明显多于M组,其中Rapa+FZ组的黄染细胞相对较少。  结论:  1.在四氯化碳诱导的肝纤维化动物模型中,观察到肝星状细胞的自噬。  2.雷帕霉素能促进肝细胞和肝星状细胞的自噬。  3.扶正化瘀方和丹参酚酸B均能对抗雷帕霉素促自噬的作用。扶正化瘀方及其丹参酚酸B抑制肝纤维化的作用机制可能部分与此有关。
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