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阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea,OSA)是一种常见的睡眠障碍性疾病。流行病学,临床及动物实验研究表明OSA或间歇低氧(intermittcnt hypoxia,IH)与糖代谢异常(即糖耐量异常/2型糖尿病)相关,且独立于肥胖的程度,因此OSA(或IH)被认为是糖代谢异常一种新的独立风险因素。OSA(或IH)可能通过多种病理生理机制导致糖代谢异常,其中氧化应激是其中最重要的一种,氧化应激增强被认为是胰岛素抵抗和糖尿病发生的重要机制。另外,Ah-Mee Park andYuichiro J.Suzuki报道急性IH(1或2周)时可导致小鼠心肌损伤,而心肌对慢性IH(4周)具有适应性,其氧化应激恢复到正常水平;Paul N.Epstein et al研究证实抗氧化剂锰超氧化物歧化酶(mitochondrial type superoxide dismutase,MnSOD)可阻止IH诱导的β细胞凋亡,这支持OSA易并发2型糖尿病是由于β细胞活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)产生增加所致;Silvia Bertuglial and RusselJ.Reiter报道褪黑素(melatonin,MEL)可抑制IH时胰岛素抵抗的发展。而抗氧化剂氮氧化物4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶(4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine1-oxyl,tempol)和还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)在IH诱导糖代谢异常中保护作用的研究尚未见报道。为此,本研究选用IH动物模型,探讨IH致糖代谢异常的可能机制以及是否胰腺对慢性IH具有适应性,同时探讨抗氧化剂tempol、GSH和MEL对IH小鼠胰腺损伤的保护作用。
材料与方法：
1、实验动物及动物模型的制备8～12周的雄性健康清洁级C57BL/6J小鼠(中国医科大学实验动物中心提供),随机分成8组:正常对照组(control group,CON)、IH2周组(2 week IH group,IH2w)、持续低氧2周组(2 week sustained hypoxia group,SH2w)、IH4周组(4 week IHgroup,IH4w)、IH+tempol2周组(IH+tempol group,IH+Tempol)、IH+GSH2周组(IH+GSH group,IH+GSH)、IH+tempol+GSH2周组(IH+tempol+GSH group,IH+Tempol+GSH)及IH+MEL2周组(IH+MEL group,IH+MEL),每组各10只。正常对照组空气条件下饲养2周;持续低氧组小鼠置于常压低氧箱中,每天持续8h,共2周,维持箱内氧浓度为(5±1)％;其余6组小鼠置于IH造模设备中,使氧浓度变化于5～21％,每天持续8 h,共2周或4周。Tempol(每日饮含1mmol/ltempol的水),GSH(10mg/100g体重)和MEL(10mg/kg体重)每天于IH前30分钟各腹腔注射1次。以上各组动物均于实验2周或4周后取材。
2、主要试剂及仪器间歇低氧仓(Oxyeycler Model A84XO,BioSpherix Instruments,Redfield,NY,USA),氧气和氮气(沈阳沈标气体有限公司),诺和灵R(Novo Nordisk,Copcnhagen,Denmark),小鼠胰岛素酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)试剂盒(Shibayagi Co.Ltd,Beijing,China),丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、GSH测定试剂盒(JiangchengBiotechnology,Nanjng,China),组织裂解液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),聚偏(二)氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜(Gelman Laboratory,Ann Arbor,MI,USA),羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(1:2000;Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA),enhanced ehemiluminescence(ECL)检测试剂(AmershamBiosciences,Westborough,MA,USA),Triozol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),tempol、GSH、melatonin试剂(Sigma,St Louis,MO,USA),荧光定量多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂盒(大连宝生物),缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling,TUNEL)法试剂盒(武汉博士德生物工程公司),PCR扩增仪(German,Biometra)等。
3、胰岛素耐量实验各组小鼠于实验的最后8h空腹,实验结束后立即按0.75U/kg剂量腹腔注射诺和灵R,于注射前(0 min)和注射后15、30、60、90 min时剪尾尖采血以罗氏(ROCHE)优越型血糖仪测定血糖水平。以0 min时血糖水平作为参比基础,测定在此基础上每一时间点血糖比率。
4、血浆胰岛素含量的测定各组小鼠空腹8h后麻醉,摘眼球取血。血样本用KDC-40低速离心机(USTCZonkia Scientific Instruments Co.Ltd,Anhui,China)3000 rpm离心15min,采用小鼠胰岛素ELISA试剂盒测定血浆胰岛素水平。
5、氧化应激指标的检测采用化学比色法测定胰腺组织MDA、SOD及GSH的水平。
6、Western blot测定胰腺组织的p-JNK和p-c-jun蛋白含量的表达水平。胰腺组织(约40 mg)于lysis缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中匀浆,该缓冲液包含1％NP40,150 mM NaCl,5 mM MgCl,10 mM羟乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid,HEPES),亮肽和胃酶抑素A。每个泳道样本总蛋60μ g被SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,而后蛋白转移到PVDF膜上(0.45μm;GelmanLaboratory,Ann Arbor,MI,USA)。用5％skin milk/10 mM Tris-HCl,pH7.4/150 mMNaCl/0.1％Tween20阻断后,膜用一抗(大鼠抗小鼠p-JNK抗体、大鼠抗小鼠p-c-jun抗体,稀释度为1:1000)4℃孵育过夜。使用羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(1:2000;Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)在室温条件下检测特定的抗体1 h,用增强化学发光观察结果。
7、Real-time PCR采用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)从胰腺组织块(约40mg)中抽提总RNA,并将约1mg的总RNA逆转录成cDNA,用PCR扩增仪(Applied Biosystems)进行基因扩增。PCR反应条件为:95cC预变性30s;95℃5s,60℃34s,42个循环扩增。Β-actin的表达水平作为内参。所用β-actin,锰超氧化物岐化酶(MnSOD)和谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase1,GPx1)引物序列用Primer510软件设计,由北京华大基因公司合成,β-actin引物序列:上游引物5-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3,下游引物5-TGTCACGCACGATTTCC-3,PCR产物长217bp;MnSOD引物序列:上游引物5-GAGCACGCTTACTACCTTC-3,下游引物5-AACATTCTCCCAGTTGATTAC-3,PCR产物长84bp;GPx1引物序列:上游引物5-GCTCACCCGCTCTTrACC-3,下游引物5-GCCGCCTTAGGAGTTGC-3,PCR产物长255bp;ABI Prism7300SDS软件记录数据并分析,将目的基因的Ct用小鼠β-actin的Ct值进行标准化,根据比较法计算基因表达相对量,采用2-△△CT法计算基因表达的相对倍数变化。
8、胰腺β细胞凋亡的检测使用TUNEL评估胰腺切片β细胞凋亡,TUNEL染色方法根据厂商说明书使用(德国罗氏诊断公司)。简单的说,胰腺切片通过20μg/ml蛋白酶K预处理15min,且用正常驴血清和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BAS)溶液所阻滞,平衡后,terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)酶在37℃时加入切片中1h,在应用Stop溶液后用10mM磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)溶液冲洗切片,在室温下滴加抗地高辛配基轭合物0.5h。然后切片采用TUNEL+胰岛素双重染色。
9、统计学处理采用SPSS16.0统计软件进行统计分析,数据以(-x±s)表示,两两比较采用t检验(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA),组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1、IH通过氧化应激诱导小鼠胰腺β细胞的凋亡,以及小鼠胰腺对慢性IH具有适应性IH2w组较CON组和SH2w组显著增加了胰岛素抵抗水平30 min(P＜0.05),60和90 min(P＜0.01);CON组和SH2w组在各时间点上胰岛素抵抗水平没有差异(P＞0.05);IH4w组和IH2w组在30 min点上胰岛素抵抗水平没有差异,在60 and90min点上胰岛素抵抗水平显著降低(P＜0.01)。IH2w组较CON组血浆胰岛素水平显著增加(P＜0.01),SH2w组与CON组血浆胰岛素水平无显著差异(P＞0.05),IH4W组较IH2w组血浆胰岛素水平显著降低(P＜0.01)。IH2w组较CON组胰腺组织中MDA水平显著增加,SOD和GSH水平显著降低(P＜0.01),SH2w组与CON组MDA、SOD及GSH水平无明显差异(P＞0.05),IH4w组较IH2w组MDA水平显著降低,SOD和GSH水平显著增加(P＜0.01)。IH2w组较CON组胰腺组织中p-JNK,p-c-Jun蛋白表达水平显著增加(P＜0.01),SH2w组与CON组胰腺组织中p-JNK,p-c-Jun蛋白表达水平无显著差异(P＞0.05),IH4w组较IH2w组胰腺组织中p-JNK,p-c-Jun蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)。IH2w组较CON组胰腺组织中MnSOD、GPx1的mRNA相对表达量显著降低(P＜0.01),SH2w组与CON组胰腺组织中MnSOD、GPx1的mRNA相对表达量无显著差异(P＞0.05),IH4w组较IH2w组胰腺组织中MnSOD、GPx1 mRNA的相对表达量显著增加(P＜0.01)。IH2w组较CON组胰腺β细胞凋亡率显著增加(P＜0.01),SH2w组与CON组胰腺β细胞凋亡率无显著差异(P＞0.05),IH4w组较IH2w组胰腺β细胞凋亡率显著降低(P＜0.01)。
2、联合应用抗氧化剂tempol和GSH对IH小鼠胰腺损伤的保护作用IH组较CON组在各时间点上胰岛素抵抗水平显著增加,30,60和90 min(P＜0.01),IH+Tempol+GSH组较IH组胰岛素抵抗水平在各个时间点上显著降低,30,60和90 min(P＜0.01),IH+Tempol、IH+GSH组与IH组在各时间点上胰岛素抵抗水平无明显差异(P＞0.05)。IH组较CON组血浆胰岛素水平显著增加(P＜0.01),IH+Tempol+GSH组较IH组血浆胰岛素水平显著降低(P＜0.01),IH+Tempol、IH+GSH组与IH组血浆胰岛素水平无明显差异(P＞0.05)。IH组较CON组胰腺组织中MDA水平显著增加,SOD和GSH水平显著降低(P＜0.01)；IH+Tempol+GSH组较IH组MDA水平显著降低、SOD及GSH水平明显增加(P＜0.01)；IH+Tempol、IH+GSH组与m组MDA,SOD和GSH水平无显著差异(P＞0.05)。IH组较CON组胰腺组织中p-JNK,p-c-Jun蛋白表达水平显著增加(P＜0.01),IH+Tempol+GSH组较m组胰腺组织中p-JNK,p-c-Jun蛋白表达水平显著降低(P＜0.01),IH+Tempol、IH+GSH组与IH组胰腺组织中p-JNK,P-c-Jun蛋白表达水平无显著差异(P＞0.05)。IH组较CON组胰腺组织中MnSOD、GPx1的mRNA相对表达量显著降低(P＜0.01),IH+Tempol+GSH组较IH组胰腺组织中MnSOD、GPx1的mRNA相对表达量显著增加(P＜0.01),IH+Tempol、IH+GSH组与m组胰腺组织中MnSOD、GPx1的mRNA相对表达量无显著差异(P＞0.05)。IH组较CON组胰腺β细胞凋亡率显著增加(P＜0.01),IH+Tempol+GSH组较IH组胰腺β细胞凋亡率显著降低(P＜0.01),IH+Tempol、IH+GSH组与m组胰腺β细胞凋亡率无显著差异(P＞0.05)。
3、抗氧化剂melatonin对IH小鼠胰腺损伤的保护作用IH组较CON组胰岛素抵抗水平显著增加,30,60和90 min(P＜0.01);IH+MEL组较IH组在各个时间点上胰岛素抵抗水平显著降低(P＜0.01)。IH组较CON组血浆胰岛素水平显著增加(P＜0.01),IH+MEL组较IH组血浆胰岛素水平显著降低(P＜0.1)。IH组较CON组胰腺组织中MDA水平显著增加,SOD及GSH水平显著降低(P＜0.01):IH+MEL组较IH组胰腺组织中MDA水平显著降低,SOD及GSH水平显著增加(P＜0.01)。IH组较CON组胰腺组织中p-JNK,p-c-Jun蛋白表达水平显著增加(P＜0.01),IH+MEL组较IH组胰腺组织中p-JNK,p-c-Jun蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)。IH组较CON组胰腺组织中MnSOD、GPx1的mRNA相对表达量显著降低(P＜0.01),IH+MEL组较IH组胰腺组织中MnSOD、GPx1的mRNA相对表达量显著增加(P＜0.01)。IH组较CON组胰腺β细胞凋亡率显著增加(P＜0.01),IH+MEL较IH组B细胞凋亡率显著降低(P＜0.01)。
结论
1、IH可致胰腺组织氧化应激状态,导致胰腺β细胞凋亡,这可能是OSA患者发生胰岛素抵抗及2型糖尿病的可能机制之一；慢性IH(4周)时胰腺的氧化应激状态较急性IH(2周)明显降低,提示胰腺对慢性IH具有适应性。
2、联合抗氧化剂tempol+GSH对IH所致小鼠胰腺损伤具有明显的保护作用,而单独应用抗氧化剂tempol或GSH对IH所致胰腺损伤无明显的保护作用。
3、抗氧化剂MEL对IH所致小鼠胰腺损伤亦具有明显的保护作用。