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本文主要从以下几个部分展开论述：
第一部分 基于机器学习的HPS患者IPVD筛选技术的研究
背景及目的：
“肝肺综合征”（hepatopulmonary syndrome,HPS）是在慢性肝脏疾病的基础上逐渐出现的肺内血管扩张（intrapulmonary vascular dilation，IPVD）与低氧血症，进而导致的一种严重肺部并发症，其发生显著增加了围术期肺部感染、呼吸衰竭，甚至死亡。对于HPS患者，早期筛选、早期介入治疗是关键；对比增强超声心动图（contrast enhanced echocardiography，CEE）是重要的诊断指标，但属于有创操作且价格较贵，难以大批量对肝硬化患者是否并发HPS进行筛选和诊断。尤其是中国作为肝病大国，目前临床上只有当肝病患者呼吸困难特别显著时，才考虑进行HPS的诊断。至今，国内外仍然缺乏快速且无创的HPS筛选诊断技术。在前期研究基础上，联合中国科学院重庆绿色智能研究院，开展基于机器学习的HPS患者IPVD筛选技术的研究，有利于围术期快速有效筛选HPS患者，从而减少围术期各种并发症的发生，具有较重要的临床意义。
方法：
1.通过伦理委员会审核，批件2017年科研第（35）号；并于clinicaltrials.gov注册，注册号：NCT03435406。选择2017年7月27日至2018年4月1日在陆军军医大学第一附属医院拟行择期手术的肝硬化患者参与研究。
2.所有纳入患者均进行了CEE、ABG和体格检查；以及从电子病历（electronic medical records，EMR）中获得生化指标。
3.使用了三种筛查策略进行分析，即临床症状策略（N策略）、临床症状+血气分析策略（CA策略），临床症状+血气分析+生化指标结果策略（CAS策略）；
4.联合中国科学院重庆绿色智能研究院，分别采用四种ML算法：逻辑回归（logistic regression，LR）、支持向量机（support vector machines，SVM）、自适应Boosting（adaptive Boosting，AdaBoost）和梯度提升决策树（gradient boosting decision tree，GBDT）来进行模型构建和预测，通过敏感性、特异性、阳性预测值、F1-SCORE和ROC曲线下的面积（area under curve，AUC）来评测筛选诊断效果。
结果：
1.总共纳入306名符合条件的患者。经过多种原因剔除后，最终纳入193名进入下一步研究。193例患者中有117例（60.6%）伴有IPVD，76例不伴有（39.4%）IPVD。两类患者在年龄、性别、BMI、高血压和糖尿病患病率、MELD评分、饮酒和吸烟指数等方面无统计学差异。
2.与不伴有IPVD患者相比较，IPVD患者在Child-Pugh评分、IBIL和肺泡-动脉氧分压差上较高；ALB、PaO2、SpO2较低，凝血酶原时间（prothrombin time，PT）更长。
3.与IPVD显着相关的临床指标包括杵状指，肝掌，蜘蛛痣，呼吸困难，腹水和肝性脑病。
4.4种算法分别对三种策略进行了建模，结果提示GBDT存在过拟合情况，LR存在欠拟合情况，SVM模型的AUC（0.82，95％CI：0.72-0.92）显着小于AdaBoost（0.88，95％CI：0.80-0.96），因此选择AdaBoost算法。
5.AdaBoost中的三种策略对比，结果提示N、CA、CAS策略三者间AUC无统计学差异，N与CA相比特异性（81.8%vs.81.8%）一致，但漏诊率（30.6%vs.18.2%）差异明显。
6.IPVD筛选策略：首先可以通过AdaBoost进行N策略的初步筛查；如果预测值小于0.538，再加测ABG进行CA策略的重新评估。
结论：
基于AdaBoost的肝硬化IPVD筛选技术，显著优于目前的单指标预测方法；而在N、CA以及CAS策略对比上，AdaBoost算法也优于SVM、LR、GBDT，可用于HPS患者围术期快速筛选，具备临床实用价值。推荐HPS的IPVD围术期筛选策略：首先通过AdaBoost进行N策略的初步筛查；如果预测值较低，再加测ABG进行CA策略的复测。
第二部分 COX-2通过PKC/Rac信号通路下调HPS患者血清诱导HPMVEC群体定向迁移能力的研究
背景及目的：
HPS的IPVD机制至今不明，导致防治困难；近年发现病理性肺血管新生（Pulmonary Pathologic Angiogenesis,PPA）促进IPVD的发生发展并导致低氧血症的恶化，在该进程中存在显著的人肺微血管内皮细胞（human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMVEC）的逆向集体迁移现象，已经成为HPS重要早期干预靶点，值得深入研究。环氧化酶（cyclooxygenase，COX）是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）转化成为前列腺素这一过程中的关键限速酶；由两种亚型组成，包括COX1和COX-2。在前期研究中，已经证明了COX-2在PMVECs中的上调促进了CBDL大鼠肺微血管中活化的CD68(+)大型噬菌体的积累，可能促进了HPMVEC逆向集体迁移，加速PPA的过程。在本研究中，研究COX-2在HPS患者血清处理下对HPMVEC定向集体迁移的影响，以及这种影响是否依赖于PKC/Rac信号通路的激活，旨在为HPS的防治寻找更优干预靶点，具有较重要的科学意义。
方法：
1.收集9名HPS患者以及12名健康人血清用于研究；
2.常规方法复苏HPMVEC细胞系，接种并爬片之后并鉴定；
3.采用Transwell、内皮细胞成管实验以及划痕实验检测HPS患者血清诱导HPMVEC群体定向迁移的影响；
4.采用Western blot法检测各时间点HPMVEC中COX2含量表达变化；ELISA法检测HPMVEC培养基中各时间点PGE2含量表达变化；采用划痕实验检测control组、HPS组、control+parecoxib组、HPS+parecoxib组的细胞定向迁移情况。
5.采用Western blot法检测正常血清和HPS病人血清刺激HPMVEC后，P-PKC含量改变；免疫荧光法检测Si-RNA PKC转录入HPMVEC后PKC的表达变化；划痕实验检测control组、HPS组、control+Si-RNA PKC组、HPS+Si-RNA PKC组的细胞定向迁移差异。
结果：
1.HPMVEC复苏存活率约为90％，形态为长梭形或多边形，胞间连接紧密，呈“铺路石”样外观；
2.Transwell的结果显示，HPS血清显著促进了上室的HPMVEC迁移到下室；成管实验的结果提示HPS患者血清促进了HPMVEC的血管生成；划痕试验结果提示HPS患者血清促进了内皮细胞在伤区内的迁移；Matlab软件计算显示在HPS患者血清的刺激下，HPMVEC迁移距离更长、面积更广、持续时间更长；
3.对照组血清对COX-2的表达没有明显影响；而HPS血清组以时间依赖性的方式上调HPMVEC中COX-2的表达；血清对PGE2的表达没有明显影响，而HPS患者血清以时间依赖性的方式上调培养基中PGE2的表达；无parecoxib的条件下，与对照组相比，HPS组划痕生长距离、运动方向的一致性更明显;加入parecoxib之后，与对照组相比，HPS组划痕生长距离、运动方向的一致性等差异无统计意义；
4.与正常血清相比，HPS血清刺激HPMVEC后，PKC磷酸化以时间依赖性的方式显著增加；COX-2选择性拮抗剂Parecoxib抑制HPS患者血清下PKC的激活，而外源性PGE2可逆转Parecoxib对PKC激活的抑制；12h后HPS组划痕生长的距离最长，边缘最完整，同时运动方向一致性最好；在HPS+Si-PKC组中，脱群细胞数量最多；在control+Si-PKC组中，持续运动的细胞比例最高；
5.36h后，HPS组中GTP-Rac的含量随时间而增多，明显高于正常组；HPS+Si-RNA PKC组与对照+Si-RNA PKC组无明显差别；但当PKC磷酸化未被干扰时，HPS+Si-RNA空载组PKC，P-PKC含量都明显增高；结果显示对照+Si-RNA空载体组，对照+Si-RNA PKC组GTP-Rac无明显区别；均低于HPS+Si-RNA空载体组，HPS+Si-RNA PKC组，其中HPS+Si-RNA空载体组含量最高。
结论：
HPS进程中COX-2通过激活PKC/Rac信号通路，进而促进HPMVEC显著性群体定向迁移，导致PPA的出现，可能是HPS时IPVD发生发展的重要原因之一；采用帕瑞昔布钠（COX-2特异性抑制剂）进行干预，可以降低PPA程度。即COX-2特异性抑制剂可能对HPS患者有潜在的围术期肺保护作用。
第一部分 基于机器学习的HPS患者IPVD筛选技术的研究
背景及目的：
“肝肺综合征”（hepatopulmonary syndrome,HPS）是在慢性肝脏疾病的基础上逐渐出现的肺内血管扩张（intrapulmonary vascular dilation，IPVD）与低氧血症，进而导致的一种严重肺部并发症，其发生显著增加了围术期肺部感染、呼吸衰竭，甚至死亡。对于HPS患者，早期筛选、早期介入治疗是关键；对比增强超声心动图（contrast enhanced echocardiography，CEE）是重要的诊断指标，但属于有创操作且价格较贵，难以大批量对肝硬化患者是否并发HPS进行筛选和诊断。尤其是中国作为肝病大国，目前临床上只有当肝病患者呼吸困难特别显著时，才考虑进行HPS的诊断。至今，国内外仍然缺乏快速且无创的HPS筛选诊断技术。在前期研究基础上，联合中国科学院重庆绿色智能研究院，开展基于机器学习的HPS患者IPVD筛选技术的研究，有利于围术期快速有效筛选HPS患者，从而减少围术期各种并发症的发生，具有较重要的临床意义。
方法：
1.通过伦理委员会审核，批件2017年科研第（35）号；并于clinicaltrials.gov注册，注册号：NCT03435406。选择2017年7月27日至2018年4月1日在陆军军医大学第一附属医院拟行择期手术的肝硬化患者参与研究。
2.所有纳入患者均进行了CEE、ABG和体格检查；以及从电子病历（electronic medical records，EMR）中获得生化指标。
3.使用了三种筛查策略进行分析，即临床症状策略（N策略）、临床症状+血气分析策略（CA策略），临床症状+血气分析+生化指标结果策略（CAS策略）；
4.联合中国科学院重庆绿色智能研究院，分别采用四种ML算法：逻辑回归（logistic regression，LR）、支持向量机（support vector machines，SVM）、自适应Boosting（adaptive Boosting，AdaBoost）和梯度提升决策树（gradient boosting decision tree，GBDT）来进行模型构建和预测，通过敏感性、特异性、阳性预测值、F1-SCORE和ROC曲线下的面积（area under curve，AUC）来评测筛选诊断效果。
结果：
1.总共纳入306名符合条件的患者。经过多种原因剔除后，最终纳入193名进入下一步研究。193例患者中有117例（60.6%）伴有IPVD，76例不伴有（39.4%）IPVD。两类患者在年龄、性别、BMI、高血压和糖尿病患病率、MELD评分、饮酒和吸烟指数等方面无统计学差异。
2.与不伴有IPVD患者相比较，IPVD患者在Child-Pugh评分、IBIL和肺泡-动脉氧分压差上较高；ALB、PaO2、SpO2较低，凝血酶原时间（prothrombin time，PT）更长。
3.与IPVD显着相关的临床指标包括杵状指，肝掌，蜘蛛痣，呼吸困难，腹水和肝性脑病。
4.4种算法分别对三种策略进行了建模，结果提示GBDT存在过拟合情况，LR存在欠拟合情况，SVM模型的AUC（0.82，95％CI：0.72-0.92）显着小于AdaBoost（0.88，95％CI：0.80-0.96），因此选择AdaBoost算法。
5.AdaBoost中的三种策略对比，结果提示N、CA、CAS策略三者间AUC无统计学差异，N与CA相比特异性（81.8%vs.81.8%）一致，但漏诊率（30.6%vs.18.2%）差异明显。
6.IPVD筛选策略：首先可以通过AdaBoost进行N策略的初步筛查；如果预测值小于0.538，再加测ABG进行CA策略的重新评估。
结论：
基于AdaBoost的肝硬化IPVD筛选技术，显著优于目前的单指标预测方法；而在N、CA以及CAS策略对比上，AdaBoost算法也优于SVM、LR、GBDT，可用于HPS患者围术期快速筛选，具备临床实用价值。推荐HPS的IPVD围术期筛选策略：首先通过AdaBoost进行N策略的初步筛查；如果预测值较低，再加测ABG进行CA策略的复测。
第二部分 COX-2通过PKC/Rac信号通路下调HPS患者血清诱导HPMVEC群体定向迁移能力的研究
背景及目的：
HPS的IPVD机制至今不明，导致防治困难；近年发现病理性肺血管新生（Pulmonary Pathologic Angiogenesis,PPA）促进IPVD的发生发展并导致低氧血症的恶化，在该进程中存在显著的人肺微血管内皮细胞（human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMVEC）的逆向集体迁移现象，已经成为HPS重要早期干预靶点，值得深入研究。环氧化酶（cyclooxygenase，COX）是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）转化成为前列腺素这一过程中的关键限速酶；由两种亚型组成，包括COX1和COX-2。在前期研究中，已经证明了COX-2在PMVECs中的上调促进了CBDL大鼠肺微血管中活化的CD68(+)大型噬菌体的积累，可能促进了HPMVEC逆向集体迁移，加速PPA的过程。在本研究中，研究COX-2在HPS患者血清处理下对HPMVEC定向集体迁移的影响，以及这种影响是否依赖于PKC/Rac信号通路的激活，旨在为HPS的防治寻找更优干预靶点，具有较重要的科学意义。
方法：
1.收集9名HPS患者以及12名健康人血清用于研究；
2.常规方法复苏HPMVEC细胞系，接种并爬片之后并鉴定；
3.采用Transwell、内皮细胞成管实验以及划痕实验检测HPS患者血清诱导HPMVEC群体定向迁移的影响；
4.采用Western blot法检测各时间点HPMVEC中COX2含量表达变化；ELISA法检测HPMVEC培养基中各时间点PGE2含量表达变化；采用划痕实验检测control组、HPS组、control+parecoxib组、HPS+parecoxib组的细胞定向迁移情况。
5.采用Western blot法检测正常血清和HPS病人血清刺激HPMVEC后，P-PKC含量改变；免疫荧光法检测Si-RNA PKC转录入HPMVEC后PKC的表达变化；划痕实验检测control组、HPS组、control+Si-RNA PKC组、HPS+Si-RNA PKC组的细胞定向迁移差异。
结果：
1.HPMVEC复苏存活率约为90％，形态为长梭形或多边形，胞间连接紧密，呈“铺路石”样外观；
2.Transwell的结果显示，HPS血清显著促进了上室的HPMVEC迁移到下室；成管实验的结果提示HPS患者血清促进了HPMVEC的血管生成；划痕试验结果提示HPS患者血清促进了内皮细胞在伤区内的迁移；Matlab软件计算显示在HPS患者血清的刺激下，HPMVEC迁移距离更长、面积更广、持续时间更长；
3.对照组血清对COX-2的表达没有明显影响；而HPS血清组以时间依赖性的方式上调HPMVEC中COX-2的表达；血清对PGE2的表达没有明显影响，而HPS患者血清以时间依赖性的方式上调培养基中PGE2的表达；无parecoxib的条件下，与对照组相比，HPS组划痕生长距离、运动方向的一致性更明显;加入parecoxib之后，与对照组相比，HPS组划痕生长距离、运动方向的一致性等差异无统计意义；
4.与正常血清相比，HPS血清刺激HPMVEC后，PKC磷酸化以时间依赖性的方式显著增加；COX-2选择性拮抗剂Parecoxib抑制HPS患者血清下PKC的激活，而外源性PGE2可逆转Parecoxib对PKC激活的抑制；12h后HPS组划痕生长的距离最长，边缘最完整，同时运动方向一致性最好；在HPS+Si-PKC组中，脱群细胞数量最多；在control+Si-PKC组中，持续运动的细胞比例最高；
5.36h后，HPS组中GTP-Rac的含量随时间而增多，明显高于正常组；HPS+Si-RNA PKC组与对照+Si-RNA PKC组无明显差别；但当PKC磷酸化未被干扰时，HPS+Si-RNA空载组PKC，P-PKC含量都明显增高；结果显示对照+Si-RNA空载体组，对照+Si-RNA PKC组GTP-Rac无明显区别；均低于HPS+Si-RNA空载体组，HPS+Si-RNA PKC组，其中HPS+Si-RNA空载体组含量最高。
结论：
HPS进程中COX-2通过激活PKC/Rac信号通路，进而促进HPMVEC显著性群体定向迁移，导致PPA的出现，可能是HPS时IPVD发生发展的重要原因之一；采用帕瑞昔布钠（COX-2特异性抑制剂）进行干预，可以降低PPA程度。即COX-2特异性抑制剂可能对HPS患者有潜在的围术期肺保护作用。