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缺血性卒中（Ischemic stroke，IS）是全球导致死亡的主要原因之一。随着新材料和新技术的发展，颈动脉支架植入术（Carotid artery stent，CAS）已经成为缺血性脑血管疾病的重要方式之一，有越来越多的患者接受了CAS治疗。然而，支架内再狭窄（In-stent restenosis，ISR）严重影响了CAS的治疗效果和预后。尽管使用药物洗脱支架（Drug eluting stent，DES）或药物涂层球囊（Drug coated balloon，DCB）降低了ISR的发生率，但是有导致血管内皮化延迟和慢性ISR的发生等问题。在缺血性脑血管介入治疗中目前尚罕有使用 DES或 DEB，而更多的是使用金属裸支架（Bare mental stent，BMS），其有更高的ISR发生率。
课题组一直专注于 ISR中VSMCs的表型转化、增殖和迁移的研究。基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）具有抑制VSMCs的增殖和迁移的作用，课题组前期开展了PPARγ受体激动剂——罗格列酮治疗ISR小型猪模型的研究，结果表明罗格列酮能明显减轻血管狭窄程度，并阻止了VSMCs的表型转化。后期进一步分析研究结果发现，罗格列酮减轻血管狭窄的作用存在性别差异：雌性动物的治疗效果较明显优于雄性动物。这种治疗效果在性别间的差异提示可能性激素参与了调控 VSMCs的增殖和迁移。既往已有研究发现 PPARγ与雌激素受体（Estrogen receptor，ER）之间存在相互作用，甚至PPARγ的某些作用受到 ER受体的调控。这些结果都提示雌激素或雌激素相关受体（Estrogen relate receptors，EER）可能通过调控VSMCs的增殖和迁移而对ISR具有治疗作用。
研究表明，女性心脑血管事件的发生率低于男性，绝经前女性的心脑血管事件低于绝经后女性，这提示雌激素对心脑血管具有保护作用。使用雌激素替代治疗（Estrogen replacement therapy，ERT）来防治心脑血管疾病虽然取得了一定的效果，但同时如男子女性化、致癌作用等一些较严重的副作用限制了动物性雌激素的使用。植物雌激素是一类广泛存在，容易从食物中获得的多酚类化合物，与动物性雌激素结构相似，虽然与雌激素受体的结合力较动物性雌激素弱，但仍发挥了与动物性雌激素类似的作用，还具有副作用较小，安全性较高的优点，非常适合作为动物性雌激素的替代品。摄入富含植物雌激素食物较多的人群心脑血管事件发生率低于摄入富含植物雌激素食物较少者提示植物雌激素对心脑血管也具有保护作用。但目前关于对植物雌激素调控 VSMCs表型转化的研究还较少，有必要对植物雌激素调控VSMCs表型转化的作用和机制进一步研究。
豆类食物是获取植物雌激素的主要来源。大豆苷元和大豆异黄酮是豆类食物中的主要植物雌激素，但它们还需要经肠道菌群进一步代谢为雌马酚后，才能进入人体发挥生物活性作用。因此，大豆苷元和大豆异黄酮等在体内的生物活性作用主要是雌马酚的作用。由于具有手性结构，因此存在两种雌马酚：左旋雌马酚（S-equol）和右旋雌马酚（R-equol），生物体内代谢产生的全是 S-equol。S-equol可发挥影响血管舒缩功能、调节血压、影响钙/钾离子通道的开放、减轻AS斑块形成和调节血管生成等作用。但S-equol对VSMCs表型转化的作用及其机制目前还不清楚。
在VSMCs中主要存在两种雌激素受体：雌激素受体（Estrogen receptor，ER）受体和G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）受体。ER受体有两种亚型，分别为 ERα和 ERβ，各自发挥着不同的生物学作用[23]。由于S-equol与ERβ的结合率远高于ERα，因此被认为是ERβ的特异性配体。GPER受体此前被称为GPR30，曾被认为是一种孤儿受体，后来才发现其可与雌激素特异性结合。研究发现，激活GPER受体对于心血管疾病具有保护作用，S-equol与GPER受体结合后可抑制NO生成的作用，此外还对乳腺癌、卵巢癌等的细胞增殖有调控作用。在治疗 ER受体缺乏的肿瘤中，GPER受体的表达和激活状态可影响药物的疗效。目前S-equol与ER受体或GPER受体结合后对VSMCs的表型转化的作用尚不清楚，需要进一步研究。
为此，本研究采用大鼠主动脉 VSMCs和球囊损伤颈总动脉的ISR大鼠模型作为研究对象，观察S-equol对体外条件下VSMCs增殖、迁移和相关表型标志物表达的作用及体内条件下对 ISR大鼠模型的血管狭窄程度、VSMCs表型标志物表达的影响。还进一步观察在体外条件和体内条件下，使用特异性受体阻断剂分别阻断 ER受体或GPER受体后，VSMCs相关表型标志物表达及下游信号通路关键分子的磷酸化。以期明确S-equol对VSMCs表型转化的作用，并初步探讨其可能机制，为临床ISR的防治提供新的理论基础及治疗的潜在新靶点。
研究方法和研究内容
1.离体研究：
1） VSMCs增殖和迁移能力的检测
体外培养大鼠主动脉 VSMCs，PDGF-BB（25ng/mL）预处理大鼠主动脉 VSMCs24h，然后再用不同浓度的 S-equol（0、10nM、100nM、10μM，100μM）处理24h，用CCK-8法检测VSMCs的增殖，用Transwell法检测VSMCs的迁移。
2）VSMCs表型的检测
将VSMCs分为4组：control组（对照组）、PDGF组、control+equol组和PDGF+equol组。PDGF组给予 PDGF-BB（25ng/mL）处理 VSMCs24h，control+S-equol组和PDGF+equol组给予不同浓度S-equol（1μM，10μM，100μM）处理24h。用Western Blot检测VSMCs收缩表型标志物α-SMA和合成表型标志物OPN的表达。
3）VSMCs的雌激素相关受体的阻断及下游信号通路磷酸化的检测
将VSMCs分为两个大组：G-15组和ICI182,780组。每个大组分为8组：PDGF-equol-G-15-组、 PDGF+equol-G-15-组、 PDGF-equol-G-15/ICI+组、PDGF-equol+G-15-组、PDGF+equol-G-15/ICI+组、PDGF-equol+G-15/ICI+组， PDGF-equol+G-15/ICI-组和PDGF-S-equol+G-15/ICI+组。用Western blot分别检测各组的VSMCs的表型标志物α-SMA和OPN的表达，以及MAPKp38和NF-κBp65的磷酸化水平。
2.在体研究
1）ISR大鼠模型的建立
采用微球囊过度扩张造成雌性SD大鼠（3-4周龄）颈总动脉内膜损伤，导致血管内狭窄，构建ISR大鼠模型。同时切除双侧卵巢以消除内源性雌激素的影响。为避免食物来源的植物雌激素的影响，用不含植物雌激素的芝麻代替了大鼠饲料配方中的豆类成分。
2）雌性SD大鼠颈总动脉VSMCs表型的检测
将雌性 SD大鼠（n=40）分为四组：对照组（Control+Vehicle），对照给药组（Control+equol）、手术组（Operation+Vehicle）和手术给药组（Operation+equol）。对照给药组和手术给药组给予 S-equol溶液（77.3μg/Kg·d）腹腔内注射给药，对照组和手术组给予相同体积的空白溶剂。颈动脉球囊损伤术后4周时处死SD大鼠，取颈总动脉，用Masson染色显示血管内狭窄程度和VSMCs增生情况，免疫组织化学染色法（Immunohistochemistry statin，IHC）检测各组血管壁VSMCs表型标志物α-SMA和OPN的表达，Western blot检测表型标志物α-SMA和OPN在各组的表达。
3）VSMCs表型转化相关信号通路关键分子磷酸化的检测
以普通雌性SD大鼠（n=40）、阻断了GPER受体的雌性SD大鼠（n=40）和阻断了ER受体的雌性SD大鼠（n=40）作为研究对象，按前述同样方法建立 ISR大鼠模型。术后分别腹腔内注射S-equol（77.3μg/Kg·d）或空白溶剂4周。将雌性SD大鼠分为两个大组：G-15组和ICI182,780组。每个大组又分为8组（10只/组）：对照组、手术组、正常给药组、手术给药组、G-15/ICI阻断正常组，G-15/ICI阻断手术组、G-15/ICI阻断正常给药组、G-15/ICI阻断手术给药组。术后4周处死大鼠，取颈总动脉。用Western blot检测各组的VSMCs表型标志物α-SMA和OPN的表达，以及MAPKp38和NF-κBp65的磷酸化水平。
4）动物尾动脉血压（Bloodpressure，BP）和血浆雌二醇（Estradiol, E2）浓度的检测
实验开始和结束时用套式血压计测量尾动脉BP，用ELISA法测量血浆中E2的浓度。
课题组一直专注于 ISR中VSMCs的表型转化、增殖和迁移的研究。基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）具有抑制VSMCs的增殖和迁移的作用，课题组前期开展了PPARγ受体激动剂——罗格列酮治疗ISR小型猪模型的研究，结果表明罗格列酮能明显减轻血管狭窄程度，并阻止了VSMCs的表型转化。后期进一步分析研究结果发现，罗格列酮减轻血管狭窄的作用存在性别差异：雌性动物的治疗效果较明显优于雄性动物。这种治疗效果在性别间的差异提示可能性激素参与了调控 VSMCs的增殖和迁移。既往已有研究发现 PPARγ与雌激素受体（Estrogen receptor，ER）之间存在相互作用，甚至PPARγ的某些作用受到 ER受体的调控。这些结果都提示雌激素或雌激素相关受体（Estrogen relate receptors，EER）可能通过调控VSMCs的增殖和迁移而对ISR具有治疗作用。
研究表明，女性心脑血管事件的发生率低于男性，绝经前女性的心脑血管事件低于绝经后女性，这提示雌激素对心脑血管具有保护作用。使用雌激素替代治疗（Estrogen replacement therapy，ERT）来防治心脑血管疾病虽然取得了一定的效果，但同时如男子女性化、致癌作用等一些较严重的副作用限制了动物性雌激素的使用。植物雌激素是一类广泛存在，容易从食物中获得的多酚类化合物，与动物性雌激素结构相似，虽然与雌激素受体的结合力较动物性雌激素弱，但仍发挥了与动物性雌激素类似的作用，还具有副作用较小，安全性较高的优点，非常适合作为动物性雌激素的替代品。摄入富含植物雌激素食物较多的人群心脑血管事件发生率低于摄入富含植物雌激素食物较少者提示植物雌激素对心脑血管也具有保护作用。但目前关于对植物雌激素调控 VSMCs表型转化的研究还较少，有必要对植物雌激素调控VSMCs表型转化的作用和机制进一步研究。
豆类食物是获取植物雌激素的主要来源。大豆苷元和大豆异黄酮是豆类食物中的主要植物雌激素，但它们还需要经肠道菌群进一步代谢为雌马酚后，才能进入人体发挥生物活性作用。因此，大豆苷元和大豆异黄酮等在体内的生物活性作用主要是雌马酚的作用。由于具有手性结构，因此存在两种雌马酚：左旋雌马酚（S-equol）和右旋雌马酚（R-equol），生物体内代谢产生的全是 S-equol。S-equol可发挥影响血管舒缩功能、调节血压、影响钙/钾离子通道的开放、减轻AS斑块形成和调节血管生成等作用。但S-equol对VSMCs表型转化的作用及其机制目前还不清楚。
在VSMCs中主要存在两种雌激素受体：雌激素受体（Estrogen receptor，ER）受体和G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）受体。ER受体有两种亚型，分别为 ERα和 ERβ，各自发挥着不同的生物学作用[23]。由于S-equol与ERβ的结合率远高于ERα，因此被认为是ERβ的特异性配体。GPER受体此前被称为GPR30，曾被认为是一种孤儿受体，后来才发现其可与雌激素特异性结合。研究发现，激活GPER受体对于心血管疾病具有保护作用，S-equol与GPER受体结合后可抑制NO生成的作用，此外还对乳腺癌、卵巢癌等的细胞增殖有调控作用。在治疗 ER受体缺乏的肿瘤中，GPER受体的表达和激活状态可影响药物的疗效。目前S-equol与ER受体或GPER受体结合后对VSMCs的表型转化的作用尚不清楚，需要进一步研究。
为此，本研究采用大鼠主动脉 VSMCs和球囊损伤颈总动脉的ISR大鼠模型作为研究对象，观察S-equol对体外条件下VSMCs增殖、迁移和相关表型标志物表达的作用及体内条件下对 ISR大鼠模型的血管狭窄程度、VSMCs表型标志物表达的影响。还进一步观察在体外条件和体内条件下，使用特异性受体阻断剂分别阻断 ER受体或GPER受体后，VSMCs相关表型标志物表达及下游信号通路关键分子的磷酸化。以期明确S-equol对VSMCs表型转化的作用，并初步探讨其可能机制，为临床ISR的防治提供新的理论基础及治疗的潜在新靶点。
研究方法和研究内容
1.离体研究：
1） VSMCs增殖和迁移能力的检测
体外培养大鼠主动脉 VSMCs，PDGF-BB（25ng/mL）预处理大鼠主动脉 VSMCs24h，然后再用不同浓度的 S-equol（0、10nM、100nM、10μM，100μM）处理24h，用CCK-8法检测VSMCs的增殖，用Transwell法检测VSMCs的迁移。
2）VSMCs表型的检测
将VSMCs分为4组：control组（对照组）、PDGF组、control+equol组和PDGF+equol组。PDGF组给予 PDGF-BB（25ng/mL）处理 VSMCs24h，control+S-equol组和PDGF+equol组给予不同浓度S-equol（1μM，10μM，100μM）处理24h。用Western Blot检测VSMCs收缩表型标志物α-SMA和合成表型标志物OPN的表达。
3）VSMCs的雌激素相关受体的阻断及下游信号通路磷酸化的检测
将VSMCs分为两个大组：G-15组和ICI182,780组。每个大组分为8组：PDGF-equol-G-15-组、 PDGF+equol-G-15-组、 PDGF-equol-G-15/ICI+组、PDGF-equol+G-15-组、PDGF+equol-G-15/ICI+组、PDGF-equol+G-15/ICI+组， PDGF-equol+G-15/ICI-组和PDGF-S-equol+G-15/ICI+组。用Western blot分别检测各组的VSMCs的表型标志物α-SMA和OPN的表达，以及MAPKp38和NF-κBp65的磷酸化水平。
2.在体研究
1）ISR大鼠模型的建立
采用微球囊过度扩张造成雌性SD大鼠（3-4周龄）颈总动脉内膜损伤，导致血管内狭窄，构建ISR大鼠模型。同时切除双侧卵巢以消除内源性雌激素的影响。为避免食物来源的植物雌激素的影响，用不含植物雌激素的芝麻代替了大鼠饲料配方中的豆类成分。
2）雌性SD大鼠颈总动脉VSMCs表型的检测
将雌性 SD大鼠（n=40）分为四组：对照组（Control+Vehicle），对照给药组（Control+equol）、手术组（Operation+Vehicle）和手术给药组（Operation+equol）。对照给药组和手术给药组给予 S-equol溶液（77.3μg/Kg·d）腹腔内注射给药，对照组和手术组给予相同体积的空白溶剂。颈动脉球囊损伤术后4周时处死SD大鼠，取颈总动脉，用Masson染色显示血管内狭窄程度和VSMCs增生情况，免疫组织化学染色法（Immunohistochemistry statin，IHC）检测各组血管壁VSMCs表型标志物α-SMA和OPN的表达，Western blot检测表型标志物α-SMA和OPN在各组的表达。
3）VSMCs表型转化相关信号通路关键分子磷酸化的检测
以普通雌性SD大鼠（n=40）、阻断了GPER受体的雌性SD大鼠（n=40）和阻断了ER受体的雌性SD大鼠（n=40）作为研究对象，按前述同样方法建立 ISR大鼠模型。术后分别腹腔内注射S-equol（77.3μg/Kg·d）或空白溶剂4周。将雌性SD大鼠分为两个大组：G-15组和ICI182,780组。每个大组又分为8组（10只/组）：对照组、手术组、正常给药组、手术给药组、G-15/ICI阻断正常组，G-15/ICI阻断手术组、G-15/ICI阻断正常给药组、G-15/ICI阻断手术给药组。术后4周处死大鼠，取颈总动脉。用Western blot检测各组的VSMCs表型标志物α-SMA和OPN的表达，以及MAPKp38和NF-κBp65的磷酸化水平。
4）动物尾动脉血压（Bloodpressure，BP）和血浆雌二醇（Estradiol, E2）浓度的检测
实验开始和结束时用套式血压计测量尾动脉BP，用ELISA法测量血浆中E2的浓度。