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MicroRNAs（miRNAs）在生命活动的许多过程中起着重要的调节作用，与众多疾病的发生、发展密切相关，因此成为诊断和预测肿瘤等疾病的生物标志物之一。研究证实，联合检测表达异常的miRNA和其他肿瘤标志物能够有效提高肿瘤的早期诊断率。然而，现有的miRNAs检测结果难以达到诊疗的要求，究其原因，首先miRNAs本身具有含量低、尺寸小、序列相似、易于降解以及特异性较差等特点提高了检测难度；其次，目前常用的miRNAs检测方法包括northern blot，荧光定量PCR以及原位杂交等，无法同时满足高灵敏度、高特异度及原位检测的临床检测需求。因此，为适应临床诊断的需求，迫切需要建立一种更加准确、可靠、简便、快速的miRNAs检测方法。
DNA除了是遗传信息的载体，还可作为结构可调纳米材料的构建基元，其程序化的识别和组装可实现对纳米材料拓扑结构和功能的精确控制。作为自组装基元的单个核酸，可以在碱基配对所导致的化学熵变化的驱动下在单链和双链之间变换。受此启发，通过合理设计DNA序列，利用不同单链DNA杂交化学熵变化的差异，可实现DNA在纳米尺度下的可控运动或执行特殊功能。随着DNA分子工程学的不断发展，DNA纳米技术已经成为一种有效的分子技术应用到生物检测、药物负载及逻辑运算等各个方面。
DNA恒温扩增技术作为DNA纳米技术的一种应用方向，以其灵敏度高、反应时间短、操作简便且无须复杂仪器等优势适用于高灵敏、高特异性的生物分析和临床诊断，尤其是床旁检测。其中杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction，HCR）是由单链触发两个DNA发夹结构发生级联杂交反应。目前，这一技术已被成功应用于SNP、miRNAs等的检测中，而非线性杂交链式反应（non-linear Hybridization Chain Reaction，NLHCR）则利用与杂交链式反应相同的原理，通过四条单双链之间的杂交置换实现级联反应，形成树枝状的DNA双链结构，从而增强信号放大的效果。
DNA纳米机器是DNA分子纳米技术近年来的发展新方向，其在受到外部刺激后，可以从一种状态转换到另一种状态，从而发展为可以由特定分子精确控制的纳米级机械零件。基于其工作原理，DNA纳米机器可以实现对特定分子的精确检测。其中DNA镊子能够在受到相应刺激后自主地开合，从而实现对靶物质的检测。目前DNA纳米机器多用于在实验室环境下检测，分析原因可能是环境的复杂性会影响其工作，甚至破坏关键结构，使其不能稳定存在。细胞内环境的复杂性使得原位检测的构建较为复杂，而DNA四面体结构已被证实可以在活细胞内保持结构的相对稳定，将DNA镊子结合四面体结构将有希望构建能够在细胞内稳定存在并保持功能的DNA纳米机器，从而实现对特定分子的精准检测。因此，本课题旨在通过DNA纳米技术实现对miRNAs的精确检测。
目的：
结合电化学传感器高灵敏度检测的优势，建立一种基于DNA恒温扩增的miRNAs电化学传感器检测技术，实现miRNAs的高灵敏高特异的检测。
结合DNA镊子的工作原理和DNA四面体的结构稳定性，设计构建能够在活细胞内稳定存在并具有原位检测及调控作用的新型DNA纳米机器，实现miRNAs的活细胞内原位检测，并调控其表达，以克服miRNAs在疾病诊疗过程中难以明确表达异常miRNAs来源的问题，为临床诊断提供更为准确的检测结果。
方法：
1、基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs电化学生物传感器的检测研究。
1）设计构建Y型探针及NLHCR反应体系。
2）在液相中对miRNAs竞争性结合Y型探针并启动NLHCR反应进行验证。
3）在电化学传感器平台上构建基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs检测。
4）对基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs电化学生物传感器进行条件优化。
5）分析基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs电化学生物传感器的灵敏度、特异性和稳定性。
6）检测临床模拟标本。
2、新型三维DNA分子镊子的构建及其对miRNAs的检测研究。
1）设计合成三维DNA分子镊子。
2）对三维DNA分子镊子进行热力学和动力学分析。
3）分析三维DNA分子镊子检测miRNAs的灵敏度和特异性。
3、基于新型三维DNA分子镊子的活细胞内miRNAs原位检测研究。
1）准备K562等细胞。
2）检测三维DNA分子镊子的稳定性和细胞毒性。
3）对三维DNA分子镊子在活细胞内miRNAs检测的条件进行优化。
4）验证三维DNA分子镊子能否用于活细胞内miRNAs半定量检测及其特异性。
5）检测临床标本。
4、模块化DNA智能镊子在活细胞内对miRNAs的调控作用的研究。
1）设计构建模块化DNA智能镊子。
2）验证模块化DNA智能镊子是否能够调控细胞内miRNAs的表达。
结果：
1、成功构建了基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs电化学生物传感器，经过条件优化之后，该miRNAs电化学传感器具有良好的线性响应，其线性范围为1fM-10pM，回归方程为：Y=0.03252lgc+0.3121，R2=0.9977，最低检测限为0.3334fM。具有良好的特异性，能够识别单碱基突变。并利用生物模拟样本对其临床应用能力进行了检测，结果证明其能够满足生物复杂样本的检测需求。
2、成功设计并合成了三维DNA分子镊子，经过热力学和动力学分析其能够在短时间内实现对靶标miRNA检测。具有良好的灵敏度和特异性，其线性范围为1nM-50nM，回归方程为：Y=1.04x+202，R2=0.9980，最低检测限为1.499nM。通过与现有DNA镊子的比较，证明了其能够作为DNA纳米机器用于miRNAs检测。
3、验证了三维DNA分子镊子对于细胞没有明显的毒性，且能够在活细胞内稳定存在6小时以上，可以满足活细胞内原位检测的需求。经过条件优化后，其能够实现在活细胞内半定量检测miRNAs表达量，可以同时检出表达异常的miRNAs和细胞。利用临床血液标本对其应用潜力进行了验证，表明三维DNA分子镊子能够实现临床简单样本的实际检测，具有应用于临床实践的潜力。
4、成功设计并合成了模块化DNA智能镊子，实现了在活细胞内对靶标miRNA的检测及调控，并通过RT-PCR和WB对miRNAs调控效果进行了验证。
结论：
1、基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs电化学生物传感器的成功构建，提高了miRNAs检测的灵敏度和特异性。该方法为DNA纳米技术应用于生物检测提供了一个可靠的检测平台，促进DNA纳米技术在分子水平得到越来越广泛的应用。
2、三维DNA分子镊子的构建及在miRNAs检测中的良好表现，证明其可以作为DNA纳米机器应用于生物检测。这种新型镊子的设计提高了DNA纳米机器的稳定性和环境适应性，有助于拓宽DNA纳米机器的应用范围。
3、三维DNA分子镊子在活细胞内的miRNAs原位检测，克服了miRNAs在疾病诊断中难以明确细胞来源的问题，为miRNAs作为生物标记物应用于临床检测提供了技术支持，其在临床标本中的应用尝试有助于后续原位检测技术的发展。
4、模块化DNA智能镊子在活细胞内对miRNAs的检测及调控的一体化操作为miRNAs的精准诊疗提供了一种可靠的方案，智能镊子的设计意味着DNA纳米机器可以由单一功能发展为复合功能，从而在生物学领域发挥更为重要的作用。
DNA除了是遗传信息的载体，还可作为结构可调纳米材料的构建基元，其程序化的识别和组装可实现对纳米材料拓扑结构和功能的精确控制。作为自组装基元的单个核酸，可以在碱基配对所导致的化学熵变化的驱动下在单链和双链之间变换。受此启发，通过合理设计DNA序列，利用不同单链DNA杂交化学熵变化的差异，可实现DNA在纳米尺度下的可控运动或执行特殊功能。随着DNA分子工程学的不断发展，DNA纳米技术已经成为一种有效的分子技术应用到生物检测、药物负载及逻辑运算等各个方面。
DNA恒温扩增技术作为DNA纳米技术的一种应用方向，以其灵敏度高、反应时间短、操作简便且无须复杂仪器等优势适用于高灵敏、高特异性的生物分析和临床诊断，尤其是床旁检测。其中杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction，HCR）是由单链触发两个DNA发夹结构发生级联杂交反应。目前，这一技术已被成功应用于SNP、miRNAs等的检测中，而非线性杂交链式反应（non-linear Hybridization Chain Reaction，NLHCR）则利用与杂交链式反应相同的原理，通过四条单双链之间的杂交置换实现级联反应，形成树枝状的DNA双链结构，从而增强信号放大的效果。
DNA纳米机器是DNA分子纳米技术近年来的发展新方向，其在受到外部刺激后，可以从一种状态转换到另一种状态，从而发展为可以由特定分子精确控制的纳米级机械零件。基于其工作原理，DNA纳米机器可以实现对特定分子的精确检测。其中DNA镊子能够在受到相应刺激后自主地开合，从而实现对靶物质的检测。目前DNA纳米机器多用于在实验室环境下检测，分析原因可能是环境的复杂性会影响其工作，甚至破坏关键结构，使其不能稳定存在。细胞内环境的复杂性使得原位检测的构建较为复杂，而DNA四面体结构已被证实可以在活细胞内保持结构的相对稳定，将DNA镊子结合四面体结构将有希望构建能够在细胞内稳定存在并保持功能的DNA纳米机器，从而实现对特定分子的精准检测。因此，本课题旨在通过DNA纳米技术实现对miRNAs的精确检测。
目的：
结合电化学传感器高灵敏度检测的优势，建立一种基于DNA恒温扩增的miRNAs电化学传感器检测技术，实现miRNAs的高灵敏高特异的检测。
结合DNA镊子的工作原理和DNA四面体的结构稳定性，设计构建能够在活细胞内稳定存在并具有原位检测及调控作用的新型DNA纳米机器，实现miRNAs的活细胞内原位检测，并调控其表达，以克服miRNAs在疾病诊疗过程中难以明确表达异常miRNAs来源的问题，为临床诊断提供更为准确的检测结果。
方法：
1、基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs电化学生物传感器的检测研究。
1）设计构建Y型探针及NLHCR反应体系。
2）在液相中对miRNAs竞争性结合Y型探针并启动NLHCR反应进行验证。
3）在电化学传感器平台上构建基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs检测。
4）对基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs电化学生物传感器进行条件优化。
5）分析基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs电化学生物传感器的灵敏度、特异性和稳定性。
6）检测临床模拟标本。
2、新型三维DNA分子镊子的构建及其对miRNAs的检测研究。
1）设计合成三维DNA分子镊子。
2）对三维DNA分子镊子进行热力学和动力学分析。
3）分析三维DNA分子镊子检测miRNAs的灵敏度和特异性。
3、基于新型三维DNA分子镊子的活细胞内miRNAs原位检测研究。
1）准备K562等细胞。
2）检测三维DNA分子镊子的稳定性和细胞毒性。
3）对三维DNA分子镊子在活细胞内miRNAs检测的条件进行优化。
4）验证三维DNA分子镊子能否用于活细胞内miRNAs半定量检测及其特异性。
5）检测临床标本。
4、模块化DNA智能镊子在活细胞内对miRNAs的调控作用的研究。
1）设计构建模块化DNA智能镊子。
2）验证模块化DNA智能镊子是否能够调控细胞内miRNAs的表达。
结果：
1、成功构建了基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs电化学生物传感器，经过条件优化之后，该miRNAs电化学传感器具有良好的线性响应，其线性范围为1fM-10pM，回归方程为：Y=0.03252lgc+0.3121，R2=0.9977，最低检测限为0.3334fM。具有良好的特异性，能够识别单碱基突变。并利用生物模拟样本对其临床应用能力进行了检测，结果证明其能够满足生物复杂样本的检测需求。
2、成功设计并合成了三维DNA分子镊子，经过热力学和动力学分析其能够在短时间内实现对靶标miRNA检测。具有良好的灵敏度和特异性，其线性范围为1nM-50nM，回归方程为：Y=1.04x+202，R2=0.9980，最低检测限为1.499nM。通过与现有DNA镊子的比较，证明了其能够作为DNA纳米机器用于miRNAs检测。
3、验证了三维DNA分子镊子对于细胞没有明显的毒性，且能够在活细胞内稳定存在6小时以上，可以满足活细胞内原位检测的需求。经过条件优化后，其能够实现在活细胞内半定量检测miRNAs表达量，可以同时检出表达异常的miRNAs和细胞。利用临床血液标本对其应用潜力进行了验证，表明三维DNA分子镊子能够实现临床简单样本的实际检测，具有应用于临床实践的潜力。
4、成功设计并合成了模块化DNA智能镊子，实现了在活细胞内对靶标miRNA的检测及调控，并通过RT-PCR和WB对miRNAs调控效果进行了验证。
结论：
1、基于Y型探针和非线性杂交链式反应的miRNAs电化学生物传感器的成功构建，提高了miRNAs检测的灵敏度和特异性。该方法为DNA纳米技术应用于生物检测提供了一个可靠的检测平台，促进DNA纳米技术在分子水平得到越来越广泛的应用。
2、三维DNA分子镊子的构建及在miRNAs检测中的良好表现，证明其可以作为DNA纳米机器应用于生物检测。这种新型镊子的设计提高了DNA纳米机器的稳定性和环境适应性，有助于拓宽DNA纳米机器的应用范围。
3、三维DNA分子镊子在活细胞内的miRNAs原位检测，克服了miRNAs在疾病诊断中难以明确细胞来源的问题，为miRNAs作为生物标记物应用于临床检测提供了技术支持，其在临床标本中的应用尝试有助于后续原位检测技术的发展。
4、模块化DNA智能镊子在活细胞内对miRNAs的检测及调控的一体化操作为miRNAs的精准诊疗提供了一种可靠的方案，智能镊子的设计意味着DNA纳米机器可以由单一功能发展为复合功能，从而在生物学领域发挥更为重要的作用。