硫磺矿硫化叶菌质粒pSSVi编码的DNA解旋酶的生化性质、寡聚状态及其位移机制的研究

• 作 者: 郭欣
• 机 构: 中国科学院大学
• 出 处: 中国科学院研究生院 中国科学院大学
• 发表日期: 2010年期

质粒pSSVi是由本实验室从硫磺矿硫化叶菌P2菌株中分离到的一个新的染色体外遗传因子并已完成测序。本研究克隆了pSSVi编码的最大的一个阅读框orf735,并在大肠杆菌中大量表达,然后经过纯化得到电泳纯的重组蛋白。　　
ORF735蛋白是一个超家族Ⅲ DNA解旋酶。在其解旋酶结构域的下游,具有一个wHTH结构域。本文详细研究了ORF735蛋白的生化性质。ORF735蛋白具有依赖ATP的3→5解旋酶活性。dATP能使该酶表现部分活性,但.ADP、GTP、CTP、UTP、dGTP、dCTP、dTTP和不水解的ATP类似物则不能。在60℃,pH为6.85有最大活性。此活性是盐敏感的且依赖二价阳离子,在Mg2+,Mn2+,Ca2+中偏好Mg2+。ORF735在测定范围37-75℃内均有解旋活性,但高温60℃条件下的酶活力是常温37℃的2倍。ORF735还具有依赖DNA的ATPase活性,且ssDNA比dsDNA能更有效地激活其ATPase活性。此外,酵母双杂交和免疫共沉淀实验揭示ORF735解旋酶与宿主引发酶的非催化亚基(Pri2)之间存在特异的相互作用。　　
ORF735蛋白在溶液中以二聚体形式存在,对高盐稳定且不需任何辅因子。Mg2+和腺嘌呤核苷酸能诱导ORF735蛋白组装成一个对盐敏感的比六聚体更大的高阶寡聚体。蛋白的N末端和C末端(分别为87和160个氨基酸残基)参与了二聚化,但对高阶寡聚体的形成则是非必需的。高阶寡聚体是ORF735蛋白结合和解开DNA的活性形式,而非二聚体。　　
凝胶阻滞实验表明ORF735蛋白对含有分叉的DNA的亲和力强于ssDNA,但不能稳定结合dsDNA。此外,ORF735蛋白对ssDNA的亲和力受到核苷酸的调控。它在ATP存在时具有对ssDNA的高亲和力,而在ADP存在时具有对ssDNA的低亲和力。　　
以上结果,为研究ORF735蛋白在pSSVi DNA复制中的功能提供了依据。