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野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestds pv.campestris,Xcc)是一种植物维管束致病菌,它能够侵染多种十字花科植物并导致黑腐病(black rot disease)的形成。同时。该病原菌已经作为细菌与植物相互作用的重要模式菌之一被广泛研究。
双组分信号转导系统(two-component signal transduction system,TCSTSs)是细菌调节多种生理代谢和细胞行为的基本控制系统。它由组氨酸蛋白激酶(histidine kinase,HK)和效应调节蛋白(response regulator,RR)组成,以蛋白质磷酸化方式进行信号转换和传递。HK具有高度变异的结构特征,能感受多种外界环境刺激,通过磷酸化,去磷酸化调控RR的活性。RR是细胞代谢和行为调节因子,其序列虽然相对保守,但具有极度多样化的功能和调节机理。我们通过定点基因敲除的方法获得了2个新的RR(XCC1958和XCC3107)与致病性相关。本课题重点研究XCC1958(RavR)的功能及其调控网络。
RavR含有3个结构域:REC,GGDEF和EAL。REC接收来自其配对的组氨酸激酶的磷酸基团而使RavR磷酸化,从而调控RavR的活性。GGDEF和EAL是细菌中比较保守的结构域,分别参与胞内新型第二信使c-di-GMP的合成和分解。c-di-GMP量的变化影响着细胞一系列的生理生化过程,例如胞外多糖的合成,生物膜的形成以及游动性。全长RavR具有c-di-GMP合成酶活性,GGDEF和EAL均没有合成或者分解功能。ravR突变导致胞外多糖和生物膜合成降低,游动能力减弱,但不显著影响Ⅱ型分泌系统和Ⅲ型分泌系统的功能。ΔravR的功能互补菌株ΔravRC的胞外多糖、游动性和生物膜以及致病能力均恢复到了野生型水平。GGDEF和EAL的缺失与全长ravR缺失的表型相似,但程度更加严重。因此,GGDEF和EAL的功能可能是不同的,但是两个结构域彼此影响。通过RT-PCR和启动子GUS融合分析表明ravR突变体内胞外多糖合成相关基因gumK和gumL及胞外酶合成(或分泌)调控基因rpfl的转录水平与野生型相比明显下降；与游动性相关的fleN和fleQ的转录也发生明显变化。因此,RavR可能是通过合成或分解c-di-GMP来调控胞外多糖和游动性相关基因的表达来实现其功能的。
通过同源比对发现RavR第496位的天冬氨酸(D496)可能是其磷酸化位点。首先通过定点突变同源重组方法创建了2个非磷酸化突变体ravR(D496A)和ravR(D496E),表型分析发现它们分别与EAL和GGDEF的缺失突变基本一致。突变蛋白RavR(D496A)既无c-di-GMP合成功能,也不具有其分解活性,也不能被磷酸化。这些结果说明D496是其磷酸基团接受位点以及磷酸化状态调控RavR的活性。体外表达RavS并进行自我磷酸化实验,结果发现RavS能够自我磷酸化,但不能将磷酸基团转移给RavR。但体内磷酸化的试验结果是只有在RavS存在时RavR才能被磷酸化。这些结果说明RavS和RavR是一对TCSTS。
ravS的缺失突变体并不表现出与ΔravR相一致的表型。ΔravS的致病能力与野生型相比并不减弱,而是轻微的增强。其胞外多糖和生物膜的合成能力与野生型相比没有显著的差别。更为特别的是双突变体ΔravS/ΔravR表现出ΔravS而非ΔravR的表型。通过RT-PCR和启动子GUS融合分析表明RavS与RavR具有不同的调控模式,ΔravS/ΔravR与ΔravS致病相关基因的表达模式相似。这表明RayS除了参与调控RavR外,还可能参与到其它基因的表达调控。
RavA缺失HK的感应结构域,只有HK保守结构域HisKA和HATPase_c结构域。全长RavA在体外不能自我磷酸化。ΔravA的致病力、游动性、胞外多糖和生物膜合成能力与野生型和ΔravR相比均显著下降,与ΔravS呈现相反的特征。但是,ΔravS/ΔravA和AravS/ΔravR/ΔravA表现出与ΔravS相似的表型而ΔravR/ΔravA具有同ΔravR相一致的表型。由于大多数HK都有激酶和磷酸酶的活性以及以上的实验结果,我们推测在Xcc胞内RavS的主要功能不是磷酸化RavR而是起到磷酸酶的活性使RavR～P去磷酸化。而RavA的主要功能可能是将磷酸基团转移给RavR。磷酸化的RavR具有c-di-GMP水解酶的功能使胞内c-di-GMP含量下降。非磷酸化的RavR具有c-di-GMP合成酶的活性,使胞内codi-GMP量上升。随着胞内c-di-GMP浓度的变化,Xcc致病相关基因的表达发生变化,从而影响胞外多糖,生物膜等致病相关因子的形成和致病力的变化。