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青蒿素是存在于中药青蒿(artemisia annua L.)中的一种含有过氧桥的倍半萜内酯化合物,是由中国科学家研发的当今最有效的抗疟药,具有高效低毒的特点,因此青蒿素的生产备受人们关注。青蒿是获取青蒿素的唯一来源,但由于青蒿植株中青蒿素的含量很低(约占干重的0.01％～0.8%),导致青蒿素价格昂贵,使许多贫困地区的人们无法获得医治,因此提高青蒿植株中青蒿素的含量或扩大青蒿素的来源,降低生产青蒿素的成本是很有实际意义的研究工作。
β-石竹烯合酶(β-caryophelene synthase,CPS)是青蒿中倍半萜合成分支途径中的一个倍半萜环化酶,它与青蒿素的合成竞争前体物质,而反义技术是抑制目的基因表达的有效手段。为了研究反义β-石竹烯合酶基因对青蒿素生物合成的影响,本文将青蒿β-石竹烯合酶基因的片段(750 bp)反向插入到植物表达载体pB1121中,并转入农杆菌EHA105。通过农杆菌介导法转化青蒿,共获得5棵转基因植株。转基因植株经过PCR和Southern-blotting检测,表明反义β-石竹烯合酶基因片段已成功整合到青蒿基因组中。通过RT-PCR分析,转基因青蒿中内源CPS基因的表达被成功抑制。对代谢产物含量的检测结果也显示,转基因青蒿中的β-石竹烯的含量明显低于对照;而青蒿素的含量较对照明显提高,最高增幅达54.9%。表明通过反义技术抑制与青蒿素生物合成竞争底物的倍半萜合酶基因的表达,能够促进青蒿素的生物合成。
青蒿素的生物合成途径属于类异戊二烯代谢途径,但其合成途径并未完全阐明。为了进一步研究青蒿素的生物合成途径,本实验室根据青蒿腺毛cDNA文库中的醇脱氢酶的EST片段,通过5RACE技术克隆到了青蒿的一个苯丙烯醇脱氢酶基因,命名为AaCAD。全长的AaCAD的cDNA为1364 bp,ORF为361个氨基酸。同源性分析的结果表明,AaCAD与拟南芥、烟草、玉米、高粱的CAD的同源性为72.88%-77.84%。通过GC和HPLC技术,研究了AaCAD的功能,结果表明,AaCAD酶在NADPH或NADH存在的条件下可以催化青蒿醛合成青蒿醇,同时也能催化香叶醛、松柏醛合成相应的醇。结合其在根中表达较强的组织特异性,我们认为该酶在植物中有一定的功能,可能在木质素合成中有一定的作用,但在青蒿素合成途径中的作用并不太大。