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低温是典型的环境胁迫因素之一,是影响植物自然分布和作物产量的重要限制因子。植物感受低温信号后启动防御机制,如改变基因转录水平、影响蛋白质合成与降解、调节蛋白修饰方式及通过染色质重塑等复杂的内在分子机制调控,使植物体内重新恢复物质和能量代谢平衡,从而能够在温度更低的环境下存活。近年来虽然植物抗冷的分子机制的研究已经取得了一些进展,但是这只是冰山一角。尤其是基于染色质重塑的调控机制在冷驯化和植物抗低温中的作用还知之甚少。本研究中,我们利用反向遗传学方法发现了一个编码RCC1(Regulators of Chromosome Condensation1)的同源基因TCF1(Tolerant to Chilling and Freezing1),并通过对TCF1基因及功能缺失突变体tcf1-1的研究,得到如下的研究结果:
1.TCF1基因受低温胁迫特异诱导表达。在22℃时,TCF1基因在拟南芥野生型(Col-0)的各个器官中均有本底少量表达；当Col-0在4℃处理6小时后,TCF1在各个组织器官中显著提高表达量；用表达ProTCF1::GUS的Col-O转基因幼苗进行组织化学染色得到了一致的结果。TCF1基因表达不受其他非生物胁迫如盐离子、渗透胁迫、ABA等胁迫处理的诱导。这些结果说明TCF1基因的表达受冷胁迫的特异诱导,而且其表达部位无组织特异性。
2.TCF1与人类RCC1作用机制不同。TCF1蛋白是人类RCC1蛋白的同源蛋白。我们研究结果显示,与RCC1特点相似,TCF1是一个核蛋白,而且与组蛋白H3,尤其是H4结合紧密,进一步证明TCF1与特异组蛋白H4(HFO2,ATSg59690)结合。但是,GEF活性试验证明TCF1仅具有很低的GEF活性,TCF1也不能互补酵母RCC1功能缺失突变体prp20在37℃的生长缺陷表型。上述结果说明TCF1在调控植物的冷驯化和抗冷响应中很可能采用了不同的机制,而不像RCC1那样调控核质GTP/GDP梯度和核质运输。
3.tcf1-1比Col-0表现出更强的冷耐受能力。tcf1-1是TCF1基因的功能缺失突变体；表型分析显示tcf1-1比Col-0对冷胁迫的耐受性显著增强；将tcf1-1与Col-0植株放在4℃冷驯化7天后再进行冷害处理,冷驯化的tcf1-1也更耐受低温。植物叶片电导率测定结果显示不管在冷驯化还是未冷驯化情况下,tcf1-1的电导率比值明显低于野生型Col-0。基因互补试验的冷害处理结果显示过表达TCF1基因的tcf1-1背景转基因植株与Col-0表型类似,因而说明tcf1-1的抗冷表型由TCF1基因的T-DNA插入突变造成。
4.TCF1基因不调控CBF基因表达。RT-PCR结果显示4℃冷处理后CBF1,CBF2和CBF3基因的表达在tcf1-1和Col-0中没有变化,另外在cbf2突变体冷驯化后,TCF1基因表达也没有变化,进一步基因表达和芯片分析结果发现CBF下游的目标基因在tcf1-1和Col-0中也没有变化。说明tcf1-1可能介导一条独立于CBFs-COR的冷信号通路。
5.TCF1基因与HOS15基因作用机制不同。HOS15是独立于CBFs-COR信号通路,与组蛋白H4结合,通过调节冷驯化过程中组蛋白H4的乙酰化水平来调节RD29A基因的表达和植物对冷的响应。Western Blot结果发现tcf1-1中组蛋白H4的乙酰化水平和野生型非常相似,RD29A基因的表达水平也没有变化,说明TCF1与HOS15作用机制不同。
6.TCF1通过与染色质结合调节基因表达。染色质免疫共沉淀技术(ChIP)显示TCF1与TCF3和HFO2编码区结合,这两个基因在TCF1基因功能缺失突变体中表达显著上调；TCF1还与受冷特异诱导的BCB编码区,PUMP5基因的启动子区结合,该基因表达在TCF1功能缺失突变体中显著下调。结果说明TCF1通过组蛋白和染色质结合分别负向和正向调节TCF3、HFO2、BCB和PUMP5基因表达,发挥其在抗冷信号中的作用；TC目的对其目标基因的调节作用还涉及到组蛋白的乙酰化和甲基化修饰。
本研究发现了一个参与植物冷驯化和抗冷调控的重要基因TCF1,更重要的是通过对TC目的功能研究揭示了一个介导植物冷驯化过程和抗冷的Chromatin BasedRegulatory新机制。这些结果为进一步揭示植物冷驯化过程和抗冷的分子机理提供了新思路,也为遗传改良作物抗冷能力提供了重要的基因资源。