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一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种活泼的气体分子，可诱导蛋白质的亚硝基化修饰，直接或间接地导致蛋白质的功能失常。帕金森氏综合症(Parkinsonsdisease，PD)是一类严重危害老年人群的神经退行性疾病。以往的研究表明，在PD病患的神经组织中广泛地存在氧化应力和亚硝基化修饰增强的现象，但是其分子机制还有待深入研究。 为了能够较为有效地分离和富集亚硝基化蛋白质，我们建立了一套整合生物素标记(Biotin switch assay)和差异凝胶电泳(Differential Gel Electrophoresis，DIGE)的蛋白质组学方法，试图对PD细胞模型中的亚硝基化蛋白质进行系统和量化分析。这种新的方法能够避免传统技术中亚硝基化半胱氨酸标记不稳定的缺点，同时可以筛选较多的亚硝基化蛋白质候选物。我们采用新技术对PD细胞模型中的亚硝基化蛋白质进行了分析，发现了泛素化途径相关蛋白质是潜在的亚硝基化修饰靶蛋白。 在PD细胞模型的亚硝基化蛋白质中，泛素接合酶Hip2是一个修饰信号较强的蛋白质。我们进一步比较了正常人与PD病患的脑组织中Hip2亚硝基化水平，发现PD脑组织中亚硝基化Hip2显著升高，但是Hip2的蛋白质丰度反而降低。为了确证Hip2蛋白质中哪个半胱胺酸基团对氧化应力比较敏感，我们定点突变了Hip2上仅有的两个半胱氨酸并测定了其酶活的变化。结果表明，Hip2的Cys170是一个亚硝基化位点，该位点的修饰导致其泛素接合酶活性降低。 在PD病患的脑组织中，泛素连接酶parkin活性的异常可造成脑组织中毒性蛋白的聚集和神经细胞死亡。Parkin是一个富含35个半胱氨酸的蛋白质，而且其中的一些半胱氨酸基团可能发生一级氧化，即形成亚硝基修饰、分子间或分子内的二硫键。在半胱氨酸富集区域，一级氧化修饰往往互为转换，不能稳定存在;而很多前期研究表明，PD病患脑组织中发生氧化修饰的parkin的确存在。我们假设，parkin的某些巯基可能形成稳定的二级氧化，对蛋白质结构与功能造成不可逆损伤。通过生理剂量的H2O2处理，可以引起parkin的连接酶活性异常。 质谱分析结果显示，H2O2与parkin的特定半胱氨酸反应，导致了蛋白中某些区域的亚磺基化和磺基化修饰;而这些区域与遗传性PD中受parkin突变影响的区域相似。在神经毒素诱导的体外PD模型中，parkin磺基化修饰与聚集显著增强;而过氧化氢酶的预处理则能中止H2O2的积累以及parkin的磺基化修饰和聚集。在神经毒素诱导的大鼠和灵长类动物PD模型以及PD病人脑组织样本中，利用免疫组化和Western blot都检测到大量的parkin聚集体存在。