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本文正文的第一部分是研究Ac/Ds因子在水稻中的转座行为。从我们实验室构建的T-DNA(Ds)插入水稻突变库中,选择了5株Ds因子分别插入在水稻第四号染色体不同位置的植株(编号E334,E335,E337,E340,E341)作为研究起始材料。将携带有Ac转座酶基因的植株AC9-4作为父本,同这5株Ds转化植株进行杂交,获得同时含有Ds因子和Ac因子的F1植株共25株。对这25株F1植株进行自交,共获得1129株具Basta抗性的F2植株。一般讲,在高等植物中转座因子先从染色体的原始插入位点切离,然后再转座至一个新的插入位点,因此我们可以用转座因子的切离作为指标来研究Ac/Ds因子在水稻中的转座行为。利用PCR的方法对这些F2植株进行了Ds因子是否从原始插入位点切离的检测。从统计结果发现在靠近第四号染色体中心粒附近的Ds转座子切离频率相对较低,而靠近第四号染色体末端区域的Ds转座子切离频率相对较高。这些实验结果表明,Ds转座子的原始插入位置对其杂交后代的切离频率有很大的影响,推测Ds的切离频率可能与原始插入位点附近的染色体结构有关。水稻第四号染色体上的Ds切离频率与其在染色体上的具体位置有显著的关系,这在实际生产中也有重要的应用价值。它提示我们在选择基因组上不同位置的Ds纯合体作为起始材料构建大规模的含不同插入位点的转座子群体时要考虑Ds的具体位置,从而使群体的构建更具有针对性,能减少田间的工作量。
本文正文的第二部分是利用T-DNA插入的水稻突变体克隆水稻的相关突变基因并研究其功能。我们选择了A654作为研究材料,A654是从水稻T-DNA插入群体中获得的一个晚开花表型的突变体。本实验室的前期遗传分析工作表明其突变表型和T-DNA插入紧密连锁。首先我们以T-DNA为标签,克隆了A654中的突变基因OsLF(Oryza Sativa LateFlowering),根据获得的全长cDNA推测的蛋白序列比较分析显示,该基因编码一个非典型的含bHLH结构域的转录因子,该转录因子不具有DNA结合的功能。表达分析表明,OsLF基因在野生型中花11中的表达非常低,而在突变体A654的茎、叶等各个组织各个时间段都有很高的表达。在野生型水稻中花11和拟南芥中过量表达OsLF基因,转基因植株都表现出类似于突变体A654的晚开花表型,进一步分析表明在突变体A654中水稻光周期途径中的关键开花基因OsGI和Hd1的表达都被下调了,本项工作重点研究了OsLF蛋白调控植株晚开花的可能机理。我们利用酵母双杂交实验,找到了4个能够与OsLF蛋白相互作用的蛋白,它们是OsPIL13、OsPIL15、OsHFR1和AtHFR1。应用拟南芥原生质体共定位实验证明OsLF蛋白能分别和OsPIL13、OsPIL15这两个蛋白共定位在细胞核中,进一步验证了酵母双杂交的结果。有报道表明OsPIL13蛋白在酵母双杂交系统中可以和水稻生物节律钟中的中心分子OsPRR1(OsTOC1)相互作用,OsPIL15蛋白也可能和OsPRR1(OsTOC1)相互作用,我们用细胞共定位实验也表明,OsPIL13和OsPIL15蛋白能分别和OsPRR1(OsTOC1)蛋白共定位在细胞核中。TOC1(APRR1)是拟南芥中的生物节律和控制开花时间以及光形态建成的关键因子之一。利用水稻全基因组序列检索发现水稻中也有一个同源基因家族对应于拟南芥节律钟的APRRs,该同源基因家族中的OsPRR1的表达也是有节律的,它的表达顶峰出现在黄昏前,与拟南芥的APRR1的表达相类似。因此DsLF蛋白很可能是通过和OsPIL13以及OsPIL15这两个蛋白相互作用形成异源二聚体,竞争了水稻OsPRR1蛋白与OsPIL13和OsPIL15这两个蛋白的相互作用,最终影响开花基因OsGI和Hd1的表达,导致水稻开花时间发生延迟。