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背景:在全世界范围内，肺癌的发病率和死亡率居高不下。因此早期诊断肺癌尤为重要。而现在的诊断技术存在一定不足。2016年以来，二代测序技术的迅猛发展使得研究者们可以大规模对人类肿瘤基因组进行快速准确的测序，从而从基因层面了解肺癌的发生发展机制以及为肿瘤的诊治提供潜在的靶向治疗和生物免疫治疗的靶点。我们在早期研究中发现LIM-only蛋白4(LMO4)是含有LIM结构域的转录因子的LIM-only(LMO)亚家族的新成员。LMO4蛋白主要定位于细胞核内，主要的功能是介导多蛋白复合物和DNA之间的相互作用。参与调控一些重要的生物学功能基因的表达，如细胞增殖和个体发育的相关基因。因此，LMO4的表达异常可能与多种人类肿瘤的发生发展相关。现有的研究表明，LMO4过表达可能会破坏Tip的正常肿瘤抑制活性，促进乳腺癌进展，并影响肺癌患者的生存。许多研究发现LMO4在表皮细胞-间质细胞转化过程中的作用：LMO4可以与参与表皮细胞-间质细胞转化信号传导的信号通路，导致基质细胞侵袭和迁移的增加。然而，非小细胞肺癌(NSCLC)中关于LMO4的研究很少见。因此，我们决定研究LMO4在肺癌发生发展中的作用，并且尝试找出可能存在的调控通路。
方法：我们收集自2010年1月至2013年3月期间共153例在山东省肿瘤医院诊治的经病理确诊为非小细胞肺癌的患者经手术切除或穿刺活检的石蜡包埋肿瘤组织样本。我们通过免疫组织化学方法对收集的肺癌标本及与之配对的周围正常组织评估LMO4的表达情况，对这153例非小细胞肺癌患者的临床特征进行总结，绘制生存曲线。另外我们进行了细胞实验，通过蛋白印迹法明确各细胞系LMO4的表达情况。我们还通过改变LMO4的表达，使用划痕试验和Transwell侵袭试验检测LMO4表达与肺癌细胞迁移和侵袭能力的关系。通过阻断AKT通路探寻可能的调节机制。统计学分析使用SPSS，采用卡方检验，费希尔精确检验及T检验，P值＜0.05认为有统计学差异。
结果：
1.153例非小细胞肺癌组织标本进行免疫组织化学分析，根据染色评分将LMO4表达情况分为高低表达组。
2.在肺癌标本中，与邻近的非癌组织(ANT)相比，LMO4表达在肿瘤组织中更高。与TNMI-II期NSCLC相比，TNMIII-IV期NSCLC的LMO4表达更高。两组患者的特征列于表1中。我们进一步检查了从153例NSCLC和其配对的正常组织中获得的标本中LMO4mRNA的表达水平。与正常组织相比，非小细胞肺癌组织中LMO4mRNA的平均表达显着升高。
3.绘制不同LMO4表达水平下非小细胞肺癌患者的总生存期(OS)的Kaplan-Meier生存曲线。与LMO4高表达的患者相比，具有低LMO4表达的NSCLC患者的总生存期(OS)显着增加(p＜0.05)。LMO4高表达组患者和LMO4低表达组患者的中位总生存期分别为24.3个月和42.3个月。在TNMI-II期的41例非小细胞肺癌患者中，LMO4低表达组与LMO高表达组的中位OS分别为53.4个月和31.8个月。在TNMⅢ-Ⅳ期患者中，与LMO4表达较高(中位OS=24.5个月)相比，具有较低LMO4表达的患者也具有较长的OS(中位OS=36.4个月)。对肿瘤大小进行分组后，独立于肿瘤大小，LMO4低表达组中的OS比在高表达组中更长。
4.在8种非小细胞肺癌细胞系中和正常肺上皮细胞系中(BEAS-2B)检测LMO4的蛋白表达及mRNA表达。与正常肺上皮细胞系相比，NSCLC细胞系的LMO4表达较高，并且结果由统计学差异(p＜0.05)。此外，每个细胞系中的LMO4蛋白表达水平趋势与其mRNA的表达水平趋势相一致。
5.对8种非小细胞肺癌细胞系LMO4水平检测，提示NSCLC细胞系H1299以及A549中的LMO4水平低于其他肿瘤细胞系，其中A549最低。
6.慢病毒感染构建过表达LMO4的A549和H1299细胞。检测mock组(阴性对照)、LMO4组(LMO4过表达)、LY294002组(使用AKT通路抑制剂)、LMO4+LY组(在LMO4过表达的基础上联合使用AKT通路抑制剂)，总MAPK，AKT和PI3K的表达未见明显差异。但过表达组与普通表达组相比，c-met和磷酸化的MAPK，AKT和PI3K表达水平升高。加用LY294002的过表达组，p-AKT，pPI3K和p-MAPK的表达未见明显升高。
7.在Transwell实验中，mock组(阴性对照)、LMO4组(LMO4过表达)、LY294002组(使用AKT通路抑制剂)、LMO4+LY组(在LMO4过表达的基础上联合使用AKT通路抑制剂)四组穿膜能力从大到小排序为LMO4＞mock＞LMO4+LY＞LY294002。
8.在划痕实验中，mock组(阴性对照)、LMO4组(LMO4过表达)、LY294002组(使用AKT通路抑制剂)、LMO4+LY组(在LMO4过表达的基础上联合使用AKT通路抑制剂)。48小时后细胞间距从小到大排序为LMO4＜LMO4+LY≈Mock＜LY294002。
结论：
1.LMO4高表达是非小细胞肺癌预后不良的因素。
2.LMO4通过促进磷酸化调控PI3K/AKT通路
3.LMO4通过调控PI3K/AKT通路调节肺癌迁移与侵袭。
方法：我们收集自2010年1月至2013年3月期间共153例在山东省肿瘤医院诊治的经病理确诊为非小细胞肺癌的患者经手术切除或穿刺活检的石蜡包埋肿瘤组织样本。我们通过免疫组织化学方法对收集的肺癌标本及与之配对的周围正常组织评估LMO4的表达情况，对这153例非小细胞肺癌患者的临床特征进行总结，绘制生存曲线。另外我们进行了细胞实验，通过蛋白印迹法明确各细胞系LMO4的表达情况。我们还通过改变LMO4的表达，使用划痕试验和Transwell侵袭试验检测LMO4表达与肺癌细胞迁移和侵袭能力的关系。通过阻断AKT通路探寻可能的调节机制。统计学分析使用SPSS，采用卡方检验，费希尔精确检验及T检验，P值＜0.05认为有统计学差异。
结果：
1.153例非小细胞肺癌组织标本进行免疫组织化学分析，根据染色评分将LMO4表达情况分为高低表达组。
2.在肺癌标本中，与邻近的非癌组织(ANT)相比，LMO4表达在肿瘤组织中更高。与TNMI-II期NSCLC相比，TNMIII-IV期NSCLC的LMO4表达更高。两组患者的特征列于表1中。我们进一步检查了从153例NSCLC和其配对的正常组织中获得的标本中LMO4mRNA的表达水平。与正常组织相比，非小细胞肺癌组织中LMO4mRNA的平均表达显着升高。
3.绘制不同LMO4表达水平下非小细胞肺癌患者的总生存期(OS)的Kaplan-Meier生存曲线。与LMO4高表达的患者相比，具有低LMO4表达的NSCLC患者的总生存期(OS)显着增加(p＜0.05)。LMO4高表达组患者和LMO4低表达组患者的中位总生存期分别为24.3个月和42.3个月。在TNMI-II期的41例非小细胞肺癌患者中，LMO4低表达组与LMO高表达组的中位OS分别为53.4个月和31.8个月。在TNMⅢ-Ⅳ期患者中，与LMO4表达较高(中位OS=24.5个月)相比，具有较低LMO4表达的患者也具有较长的OS(中位OS=36.4个月)。对肿瘤大小进行分组后，独立于肿瘤大小，LMO4低表达组中的OS比在高表达组中更长。
4.在8种非小细胞肺癌细胞系中和正常肺上皮细胞系中(BEAS-2B)检测LMO4的蛋白表达及mRNA表达。与正常肺上皮细胞系相比，NSCLC细胞系的LMO4表达较高，并且结果由统计学差异(p＜0.05)。此外，每个细胞系中的LMO4蛋白表达水平趋势与其mRNA的表达水平趋势相一致。
5.对8种非小细胞肺癌细胞系LMO4水平检测，提示NSCLC细胞系H1299以及A549中的LMO4水平低于其他肿瘤细胞系，其中A549最低。
6.慢病毒感染构建过表达LMO4的A549和H1299细胞。检测mock组(阴性对照)、LMO4组(LMO4过表达)、LY294002组(使用AKT通路抑制剂)、LMO4+LY组(在LMO4过表达的基础上联合使用AKT通路抑制剂)，总MAPK，AKT和PI3K的表达未见明显差异。但过表达组与普通表达组相比，c-met和磷酸化的MAPK，AKT和PI3K表达水平升高。加用LY294002的过表达组，p-AKT，pPI3K和p-MAPK的表达未见明显升高。
7.在Transwell实验中，mock组(阴性对照)、LMO4组(LMO4过表达)、LY294002组(使用AKT通路抑制剂)、LMO4+LY组(在LMO4过表达的基础上联合使用AKT通路抑制剂)四组穿膜能力从大到小排序为LMO4＞mock＞LMO4+LY＞LY294002。
8.在划痕实验中，mock组(阴性对照)、LMO4组(LMO4过表达)、LY294002组(使用AKT通路抑制剂)、LMO4+LY组(在LMO4过表达的基础上联合使用AKT通路抑制剂)。48小时后细胞间距从小到大排序为LMO4＜LMO4+LY≈Mock＜LY294002。
结论：
1.LMO4高表达是非小细胞肺癌预后不良的因素。
2.LMO4通过促进磷酸化调控PI3K/AKT通路
3.LMO4通过调控PI3K/AKT通路调节肺癌迁移与侵袭。