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细胞壁是植物特有结构,是细胞与环境进行物质、信息交流的通道,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。细胞壁多糖是重要的可再生资源:秸秆还田能够增加土壤有机质,降低化肥使用量,秸秆发酵生产的乙醇是新兴的生物能源,有利于减少大气污染,缓解能源匮乏的矛盾,有助于可持续发展。纤维素是细胞壁主要成分,直接决定细胞壁性能。纤维素也是最丰富的天然化合物,在农、林、纺织中占有重要地位。
目前纤维素合成及沉积机制还很不清楚,许多观点还处在假说阶段,需要实验证掘的支持。brittle culm11(bc11)是EMS诱变产生的水稻脆秆突变体,和课题组之前发现的bc1、bc10为非等位突变体,因而我们对bc11进行基因克隆与功能研究,希望为水稻细胞壁合成的分子机制提供新的线索。
突变体bc11主要表型为茎秆机械强度显著下降,易折断。bc11还具有植株矮生、发育迟缓和严重烧尖等表型。细胞学研究表明bc11茎秆厚壁细胞细胞壁变薄,薄壁细胞塌陷,形状不规则。透射电镜观察显示,突变体厚壁组织的初生壁无显著变化,而次生细胞壁结构异常,异常沉积的高电子密度物质取代了低电子密度的均质的纤维素。对突变体和野生型的细胞壁化学成分测定显示,突变体茎秆细胞壁中的纤维素含量严重降低,木质素含量的变化不显著。进一步的中性单糖成分分析显示,突变体细胞壁中葡萄糖含量显著降低,而木糖、鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖等均有不同程度升高。免疫组化染色也证明突变体中半纤维素和果胶在厚壁细胞和胞壁细胞中有不正常分布的现象。
遗传分析表明,bc11突变表型由单一隐性基因控制。为通过图位法克隆BC11基因,我们将BC11基因初步定位在1号染色体上RM1183和RM1216之间的4.7cM区间内;进一步的精细定位和测序发现突变体的OsCESA4基因发生了错义突变(G2572R),导致甘氨酸(GGG)变成精氨酸(AGG)。转基因互补实验证明OsCESA4可以恢复突变体的所有突变表型。OsCESA4基因在水稻生长发育的各个时期和部位均有表达,尤其在茎秆中表达量最高。GUS染色结果显示,OsCESA41主要在厚壁组织及维管束中表达。
生物信息分析显示OsCESA4蛋白有8个跨膜结构,2个位于N端,6个位于C端。OsCESA4蛋白的N端含有锌指结构(Zinc-binding Domain,ZnBD),并且含有行进性糖基转移酶(Processive Glycosyltransferase)的典型基序:D,D,D,QXXRW。利用OsCESA4的N端氨基酸作为抗原,制备了多克隆抗体检测蛋白水平的表达。Western杂交实验说明突变体和野生型具有相同的OsCESA4蛋白含量。采用DEX/PEG分相系统分离内膜相和质膜相后,杂交结果显示OsCESA4蛋白在内膜系统的含量高于野生型,而在质膜的含量低于野生型。OsCESA4的突变位点位于第5个跨膜结构域,且远离蛋白的活性区域。而过量表达突变体cDNA能互补突变体表型,其原因是位于质膜上bc11的丰度恢复到了野生型的水平,因而我们推测该氨基酸在纤维素合酶复合体嵌入质膜的过程中起着重要的作用。