基于花生毛状根体系研究转录因子AhAREB1对AhNCED1表达调控

来源 :华南师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wuzhigang3481
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发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染植物外植体诱导植物产生转基因毛状根,获得的毛状根具有生长速度快、侧根丰富、激素自养、外源基因稳定遗传等特点,是研究花生基因功能的良好材料。AREB/ABF是一类重要的植物bZIP转录因子,能特异识别基因启动子上的ABRE顺式元件,在ABA依赖型胁迫应答途径中发挥作用。前期研究表明,ABA合成关键酶NCED基因上存在ABRE顺式元件,能够被AREB识别并结合,为ABA合成过程中的反馈调节提供了证据。本论文建立了优化发根农杆菌K599侵染花生外植体产生毛状根的体系,以获得的转基因毛状根为材料,明确毛状根中转录因子AhAREB1超表达在细胞响应干旱的作用,同时进一步探讨AhAREB1调控AhNCED1表达及该过程中的AhAREB1蛋白必需基序。主要研究结果如下:  1、构建p35S::AhAREB1-GFP植物表达载体,以粤油7号花生为材料,对花生毛状根诱导条件进行了优化,研宄了不同外植体类型、菌液浓度、侵染时间、共培养时间对花生生根诱导率的影响,结果显示:带叶柄的嫩叶为外植体;侵染菌液浓度OD600为0.6;侵染时间为15分钟;共培养时间为2d的培养条件最佳,且在最佳优化条件下进行花生毛状根的诱导,诱导率能达到88%左右;  2、通过发根农杆菌K599介导转化花生外植体诱导产生了转基因毛状根,采用PCR、Western Blot、Realtime PCR等方法确定外源基因已整合到花生基因组中,分析鉴定筛选获得AhAREB1超表达毛状根;  3、在干旱处理下,与花生对照组毛状根(转空质粒)相比,AhAREB1超表达毛状根的质壁分离现象不明显,O-2水平较低;超表达AhAREB1毛状根显著提高ABA信号转导途径中四个抗干旱相关基因WRKY33(编码WRKY转录因子)、MYB92(编码MYB转录因子)、PYL5(编码ABA受体)、DHN2(编码脱水素)的表达,明确了AhAREB1转录因子对超表达毛状根细胞响应干旱的作用;  4、通过Western Blot分析了干旱胁迫下AhAREB1蛋白的表达趋势,干旱胁迫1-5h内其表达逐渐升高,5h后开始下降,进一步证实了花生响应干旱胁迫时激活了AhAREB1转录表达;  5、在正常和干旱处理下,AhAREB1超表达毛状根中AhNCED1的表达显著降低,推测转基因毛状根中AhAREB1的超表达可能负调控AhNCED1基因的转录水平;  6、通过细胞染色质免疫共沉淀证明,AhAREB1能与AhNCED1上的ABRE元件结合,表明AhAREB1通过与这些ABRE元件结合负调控AhNCED1基因的表达;构建不同保守结构域分别缺失的AhAREB1载体DEL1、DEL2、DEL3,转化得到的转基因毛状根进行ChIP-QPCR分析,保守结构域C1(DEL1)、C3(DEL3)的缺失明显影响了AhAREB1转录因子与AhNCED1启动子的结合;  7、利用p35S::AhAREB1、p35S::DEL1、p35S::DEL2、p35S::DEL3分别与pAhNCED1::Fluc瞬时转化拟南芥原生质体,分析发现AhAREB1能显著性下调pAhNCED1::Fluc的表达,并且保守结构域C1(DEL1)和C2(DEL2)的缺失明显影响了AhAREB1对基因AhNCED1表达的调控;  综上,发根农杆菌K599侵染花生外植体产生毛状根的体系可以用于花生基因功能的研究,利用该体系进一步确认AhAREB1转录因子在花生响应干旱胁迫的作用,超表达AhAREB1通过与AhNCED1基因启动子上的ABRE元件负调控AhNCED1基因的转录水平;保守结构域C1、C3影响AhAREB1转录因子与AhNCED1启动子上的ABRE元件的结合;由保守结构域C1、C2在AhAREB1转录因子负调控AhNCED1的表达中发挥作用,上述结果为深入探索花生在响应水分胁迫时AhAREB1转录调节AhNCED1的分子调控机制提供基础。
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