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干细胞研究与应用是一门新兴的学科，是生命科学近10年来最令人瞩目的领域之一，在细胞治疗、组织器官修复、发育生物学和药物学等领域有着极为广阔的应用前景，为中医药现代化研究带来新的挑战，也为中医药研究带来了新的切入点。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是目前研究最多、应用潜力最大的干细胞之一，MSCs不仅是组织工程理想的种子细胞，而且是研究增殖与分化机理的理想模型。但是，骨髓中MSCs含量极少，长期增殖活性较弱，扩增速度较慢，容易向脂肪分化衰老，无法满足临床需求。众多的体外转染和体内移植研究表明，移植的MSCs增殖活力不够，存活量较少，严重限制了MSCs的应用研究。外源性的生长因子如碱性成纤维生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF-β)和骨形态发生蛋白(BMP)等都能显著促进MSCs的增殖，但BMPs等在体内极易被降解破坏，半衰期很短，价格昂贵;bFGF、BMPs等转基因能使细胞因子在MSCs稳定表达，端粒酶转染也可使MSCs成永生化干细胞，都能长期促进MSCs增殖，但是存在形成肿瘤的潜在危险。因此，保持MSCs的增殖能力而又保证其生长的安全性成为迫切需要解决的重大问题。 应用肾主生长中医药理论，从中药中寻找促进MSCs生长活性的有效组分成为我们的研究目标。我们前期血清药理学研究结果表明，含龟板血清可以促进体外培养时MSCs的增殖。进一步提取龟板，将龟板用递增极性溶剂分步提取，所得石油醚部位，乙酸乙酯部位，乙醇部位和水溶性部位提取物筛选促MSCs增殖活性有效组分，使用密度梯度法分离大鼠骨髓间质干细胞进行培养，经5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记、CD44染色及两者双重染色和流式细胞术检测CD44鉴定后，观察在培养液中添加不同浓度龟板提取物条件下MSCs的生长变化;应用形态学、MTT法和Brdu、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学方法、流式细胞术检测细胞周期分布测定细胞增殖活性，确定龟板乙酸乙酯部位为有效活性组分。进一步将龟板乙酸乙酯部位溶于二甲亚砜DMSO中，制备为龟板乙酸乙酯部位注射剂，分别给予低、高剂量龟板乙酸乙酯部位腹腔注射大鼠，以细胞周期S期为促MSCs增殖的药理学指标，结果表明龟板乙酸乙酯部位以时效和量效依赖方式促进在体骨髓MSCs增殖效果。 龟板提取物以结构特异性系列物形式存在活性物质群，促进MSCs增殖效应是其相应系列物所产生作用整合的假说。龟板提取物所含化学成分主要为脂肪酸类、脂肪酸酯类、甾体等三大类系列物;进一步将龟板提取物应用石油醚:乙酸乙酯递增极性溶剂洗脱，分离得到10种组分（编码为A-J）。单独应用分别呈不同模式作用于MSCs增殖，而按龟板提取物中自然比例配伍应用，终末效应则呈协同作用，作用模式迥异于现代化学药物。10种组分以不同浓度组份及配伍加入体外培养的MSCs中，培养3d后，MTT法和流式细胞术测定细胞增殖活性。与对照组比较，A、B、H、I20μl浓度组和C、F(10-20μl)浓度组和J(5-20μl)浓度组细胞活性显著提高，与J组份配伍细胞活性提高(p＜0.05);E(2-20μl)浓度组细胞活性显著降低，与E组份配伍组细胞活性显著降低;D和G组细胞活性没有影响。7个组分均促进MSCs增殖，以J组份最强，与J组份配伍作用提高;E组份抑制MSCs增殖，与E组份配伍作用降低。J组份和E组份经GC-MS和HPLC检测，并与十六碳羧酸、甾酯、十八碳羧酸、十八碳羧酸甲酯标准品的增殖活性比较，证实龟板提取物J组份中十六碳羧酸和甾酯为MSCs增殖的正调控成分，龟板提取物E组份中十八碳羧酸和十八碳羧酸甲酯为MSCs增殖的负调控成分。 龟板提取物促MSCs增殖作用可能与BMP4表达上调有关。观察龟板提取物对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外增殖过程中骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein4，BMP4)表达的影响。使用密度梯度法分离大鼠骨髓间充质干细胞进行培养，传代纯化，在基础培养液中添加不同浓度龟板提取物，用荧光定量PCR和原位杂交方法检测BMP4 mRNA表达，用ELISA、免疫组化和免疫荧光法检测BMP4蛋白表达的变化。龟板提取物以浓度依赖方式促进MSCs的BMP4mRNA及其蛋白表达，BMP4蛋白和mRNA表达情况相一致。 龟板提取物促进BMP4活性依赖性释放促MSCs增殖。在原代培养MSCs中探讨PTE通过BMP4自分泌途径促增殖活性机制。MSCs表达BMP受体Ⅰ型和Ⅱ型，在这些细胞内，BMP4促进MSCs增殖，因此，我们提出PTE激活BMP4合成和释放，通过BMP4自分泌途径促进MSCs增殖的假设，为了证实这一假设。不同浓度PTE及其PTE中化合物促进培养基中BMP4含量。在PTE作用培养基中增高BMP4随后增强BMPIB受体表达，提示PTE增加BMP4释放而激活作用，胞外BMP4活性阻断剂noggin和中和BMP4抗体被应用，两者都能部分阻断PTE介导MSCs增殖和BMPIB受体表达。因此，我们证实了PTE促进BMP4的自分泌途径激活BMPIB受体，导致MSCs增殖。 PTE促MSCs增殖和BMP4表达在临床应用有三方面意义。首先，PTE为易于获取的活性组份，促进MSCs增殖来治疗局部骨胳缺陷。其次，PTE促进BMP4表达在治疗骨病骨胳修复和骨质疏松症方面提供一条新途径。因为MSCs尚未有高效基因转导，以作为治疗要求工程细胞数量。而且，在MSCs内的基因表达调控亦存在问题。最后，PTE作用MSCs的最大愿望就是重组骨胳系统，以治疗系统性骨病。 我们未来工作将集中在PTE定向诱导MSCs分化。目前，骨髓作为试验和临床研究MSCs的主要来源。MSCs具有多向分化和扩增性，通常作为组织工程理想种子细胞。具有结构和功能的组织工程要求在生物材料上种植有定向特异分化和特异细胞表型的。因此，今后探讨PTE诱导MSCs体内和体外分化是重要的。