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目的：
1.观察yoeB基因对Newman及JE2菌株浮游状态下的生长能力和耐药的影响。
2.观察yoeB基因对Newman及JE2菌株生物膜状态下的生长能力和耐药能力的影响。
3.评价yoeB基因对Newman及JE2菌株生物膜主要成分含量及相关类型生物膜形成的影响。
4.观察Sub-MIC抗生素对于Newman及JE2菌株浮游状态生长的影响，观察Sub-MIC抗生素及小檗碱对于Newman及JE2菌株生物膜形成的影响，探讨yoeB基因对于该表型的影响。
5.建立小鼠肌肉金葡菌感染模型、钛棒皮下植入感染模型及PJI模型，初步探讨yoeB基因对于小鼠肌肉感染模型和钛棒钛棒皮下植入模型细菌负荷的影响。
方法：
第一部分：1.金葡菌浮游状态的生长及耐药：使用麦氏比浊法将菌液浓度调整为0.5麦氏浊度,分别取100μL稀释液加至无菌96孔并置于37℃恒温培养箱孵育，使用分光光度仪每小时监测各菌液在600nm波长时的吸光值至6小时；采用E-strip法测量各菌株MIC值，将各待测菌株加入含10×MIC浓度抗生素培养基溶液中并置于恒温摇床治疗，于治疗24小时后采用平板倍比稀释法测量抗生素治疗后各菌液CFU并计算细菌生存率。2.金葡菌生物膜的形成和及耐药：生物膜的形成能力检测采用半定量和定量两种方法，半定量法检测具体如下：将各待测菌株调至相同细菌浓度后并取取100μL样品加至无菌96孔板孵育24小时，以10%浓度的福尔马林固定后以0.1%的结晶紫染色，去离子水漂洗4次后室温风干，加入30%的冰醋酸以溶解结晶紫染料并在600nm波长时测量各样品吸光值；定量检测具体方法如下：将定量后的细菌和无菌钛棒加入含有5mlTSB的无菌6孔板放入培养箱培养至72小时，各取4根待测钛棒进行超声裂解器，采用琼脂平板倍比稀释法对超声裂解液中的细菌浓度定量分析；生物膜的抗生素耐药实验在培养72小时后进行，分别加入10×MIC浓度的头孢唑林和万古霉素治疗24-48小时，分别于治疗后24小时和48小时对钛棒上的细菌定量，计算其生存率。3.yoeB基因对Newman及JE2菌株生物膜主要成分含量影响：首先对生物膜样品进行处理，过滤除菌后分别根据需要使用试剂去除样品中的蛋白质、多糖及DNA。首先采用BCA法测量生物膜中总蛋白的含量，即根据已知的蛋白标准品浓度建立标准曲线，推测生物膜中的蛋白浓度；采用核酸荧光染色法测量生物膜中eDNA浓度，即对生物膜中的eDNA染色后测量其荧光值而推断核酸浓度。采用化学发光法测量生物膜中多糖的浓度。分别使用proteinaseK、高碘酸钠和DNaseI对各样本治疗以去除生物膜中的蛋白质、多糖及DNA成分，判断治疗后WT及yoeB基因突变株生物膜的变化。4.亚抑菌浓度抗生素及小檗碱对于金葡菌浮游状态生长及生物膜形成的影响。在96孔板采用二倍稀释法建立各亚抑菌浓度，加入菌液后放入暖箱孵育24小时，观察不同亚抑菌浓度条件下WT及yoeB突变体的生长能力差异。分别使用0.5×MIC、0.25×MIC浓度抗生素对钛棒生物膜诱导并与没有添加抗生素的对照组比较，使用平板稀释法检查各组生物膜CFU的差异；中药黄连有效成分小檗碱对于金葡菌生物膜形成的影响，使用CLSI检测WT及yoeB突变株对小檗碱的MIC，使用10×MIC浓度的小檗碱分别对各组钛棒表面生物膜分别干预，具体方法参照第二部分。
第二部分：建立小鼠肌肉感染模型、皮下植入钛棒周围感染模型及PJI模型。将24只健康的C57BL/6小鼠随机分为WT组、yoeB1突变组和yoeB2突变组。首先建立小鼠肌肉感染模型，细菌定量为1×107CFU/ml，对小鼠大腿备皮消毒后注射100μL菌液，72小时后处死小鼠，取大腿肌肉组织研磨后进行细菌定量分析。皮下植入钛棒感染模型是将无菌的钛棒插入小鼠的皮下，再经切口注射10μL菌液(1×106CFU/ml)造成感染，72小时后取出钛棒进行细菌定量。PJI模型与皮下感染模型类似，内植入物使用3D打印金属材料，手术过程与临床类似，即在无菌条件下切除小鼠半月板及韧带组织，经针头开口后插入涂抹有骨水泥的金属假体，缝合完毕后经关节腔注射10μL菌液(1×106CFU/ml)造成感染，72小时对假体及周围组织细菌进行定量。
结果：
1.yoeB1和yoeB2基因突变株浮游状态下生长速度快于WT，浮游状态下的WT对头孢唑林和万古霉素菌耐药性均强于yoeB基因突变组。Newman的WT株、yoeB1和yoeB2突变株24小时10×MIC头孢唑林和万古霉素生存率分别为0.05%、0.02%、0.02%和0.17%、0.03%、0.08%。JE2的WT株、yoeB1和yoeB2突变株使用10×MIC浓度头孢唑林和万古霉素24小时生存率分别为0.46%、0.03%、0.16%和0.17%、0.02%、0.05%。
2.半定量和定量生物膜分析显示yoeB1和yoeB2基因突变株在96孔板和钛棒表面的生物膜形成能力均小于WT且对抗生素更加敏感。定量分析显示Newman菌株yoeB1和yoeB2基因缺失组生物膜总量分别较WT减少约超过50%，JE2菌株yoeB1和yoeB2基因缺失组生物膜总量分别较WT减少约6倍，Newman的WT、yoeB1和yoeB2突变株在10×MIC浓度头孢唑林和10×MIC浓度万古霉素48小时生存率分别为4.7%、2.2%、1.2%和3.7%、0.4%、0.7%。JE2的WT、yoeB1和yoeB2突变株在10×MIC浓度头孢唑林和10×MIC浓度万古霉素48小时生存率分别为7.2%、0.8%、1.4%和11.4%、7.4%、4.4%
3.生物膜成分分析显示Newman和JE2的生物膜中总蛋白质浓度在WT和yoeB突变株无统计学差异，对WT及yoeB1和yoeB2基因突变株使用蛋白酶K治疗后发现，WT及yoeB基因缺失组均表现为CFU明显降低；生物膜eDNA成分分析表明Newman的yoeB1和yoeB2基因缺失株比WT的EPS中eDNA含量明显降低。使用DNaseI治疗发现WT组的生物膜明显下降而yoeB组无明显变化。JE2菌株的各组eDNA含量无明显差异，使用DNaseI治疗后各组生物膜也无明显变化；生物膜PIA成分分析显示Newman和JE2株的WT组含量明显高于yoeB基因突变组，使用高碘酸钠治疗后发现Newman的WT生物膜总量上升，余组无明显差异。
4.各亚抑菌浓度头孢唑林和万古霉素对Newman和JE2的WT和yoeB突变株浮游状态的生长无明显影响，与不含抗生素的对照组比较无统计学差异。然而，对于Newman的WT使用0.5×MIC诱导后，生物膜总量较PBS组减少，使用0.25×MIC诱导后，生物膜总量较PBS组增加，然而低剂量抗生素诱导生物膜增加的这种现象在yoeB2突变株中消失。进一步分析生物膜的成分发现，低剂量抗生素诱导组生物膜中eDAN含量增加，使用DNaseI治疗后，这种诱导作用消失；小檗碱对两种金葡菌的MIC在WT和yoeB突变株直接无统计学差异，其中Newman的小檗碱MIC为256微克/ml，JE2的小檗碱MIC为128微克/ml，使用10×MIC浓度的小檗碱对两种金葡菌干预后发现，yoeB突变株对小檗碱较WT敏感。Newman和JE2的WT、yoeB1和yoeB2突变株钛棒生物膜在10×MIC浓度小檗碱干预48小时生存率分别为4.2%、1.4%、1.9%和0.9%、0.3%、0.5%。
5.小鼠肌肉感染模型显示JE2菌株的WT组较yoeB突变株具有更强的致病力，WT组小鼠肌肉组织中具有更多的细菌形成，分别是yoeB1和yoeB2突变株的2.4倍和2.5倍。小鼠背部皮下钛棒感染模型也得出了类似的结果，JE2菌株的WT组钛棒表面可粘附更多的细菌,分别是yoeB1和yoeB2组的1.3倍和1.5倍。
结论：
1.删除yoeB基因可以加快Newman和JE2在TSB中的生长，可能是由于删除毒素基因后利于细菌的生长。然而yoeB基因突变株在96孔板及钛棒表面的生物膜形成减少，说明同一基因对于生物膜和浮游细菌可能起到完成不同的作用。进一步的生物膜成分分析显示，yoeB基因参与调节不同的生物膜成分而参与到不同类型生物膜的形成过程中来。化学发光法表明两种菌株的yoeB基因参与细菌生物膜中的PIA的产生，因此删除yoeB基因会减少PIA的形成从而影响PIA依赖性生物膜的形成，同样的，删除Newman菌株中的yoeB基因会降低eDNA的释放，影响了eDNA依赖性生物膜的形成。
2.yoeB基因参与两种菌株对抗生素的耐药，浮游细菌实验及生物膜使用均表现为yoeB突变株降低了对头孢唑林和万古霉素的耐药，使用小檗碱干预两种细菌的生物膜也得出同样类似的结果，说明yoeB基因不但是毒素基因，同样是一种耐药基因，具体该基因如何增加细菌的耐药需要进一步研究。
3.使用0.25×MIC浓度的抗生素对Newman的WT干预后增加了细菌生物膜的形成，成分分析显示该组生物膜中的eDNA含量增加，使用DNaseI干预后这种亚抑菌浓度促使生物膜增加的现象消失，说明亚抑菌浓度抗生素通过增加eDNA依赖型生物膜而增加生物膜的总量。删除yoeB基因可以降低eDNA的产生，因此对于yoeB基因突变株使用亚抑菌浓度干预后没增加该类型生物膜的形成。
4.动物实验得出与体外实验类似结果，说明yoeB不但在体外可以增加细菌生物膜的形成，在动物体内也可发挥该作用。
1.观察yoeB基因对Newman及JE2菌株浮游状态下的生长能力和耐药的影响。
2.观察yoeB基因对Newman及JE2菌株生物膜状态下的生长能力和耐药能力的影响。
3.评价yoeB基因对Newman及JE2菌株生物膜主要成分含量及相关类型生物膜形成的影响。
4.观察Sub-MIC抗生素对于Newman及JE2菌株浮游状态生长的影响，观察Sub-MIC抗生素及小檗碱对于Newman及JE2菌株生物膜形成的影响，探讨yoeB基因对于该表型的影响。
5.建立小鼠肌肉金葡菌感染模型、钛棒皮下植入感染模型及PJI模型，初步探讨yoeB基因对于小鼠肌肉感染模型和钛棒钛棒皮下植入模型细菌负荷的影响。
方法：
第一部分：1.金葡菌浮游状态的生长及耐药：使用麦氏比浊法将菌液浓度调整为0.5麦氏浊度,分别取100μL稀释液加至无菌96孔并置于37℃恒温培养箱孵育，使用分光光度仪每小时监测各菌液在600nm波长时的吸光值至6小时；采用E-strip法测量各菌株MIC值，将各待测菌株加入含10×MIC浓度抗生素培养基溶液中并置于恒温摇床治疗，于治疗24小时后采用平板倍比稀释法测量抗生素治疗后各菌液CFU并计算细菌生存率。2.金葡菌生物膜的形成和及耐药：生物膜的形成能力检测采用半定量和定量两种方法，半定量法检测具体如下：将各待测菌株调至相同细菌浓度后并取取100μL样品加至无菌96孔板孵育24小时，以10%浓度的福尔马林固定后以0.1%的结晶紫染色，去离子水漂洗4次后室温风干，加入30%的冰醋酸以溶解结晶紫染料并在600nm波长时测量各样品吸光值；定量检测具体方法如下：将定量后的细菌和无菌钛棒加入含有5mlTSB的无菌6孔板放入培养箱培养至72小时，各取4根待测钛棒进行超声裂解器，采用琼脂平板倍比稀释法对超声裂解液中的细菌浓度定量分析；生物膜的抗生素耐药实验在培养72小时后进行，分别加入10×MIC浓度的头孢唑林和万古霉素治疗24-48小时，分别于治疗后24小时和48小时对钛棒上的细菌定量，计算其生存率。3.yoeB基因对Newman及JE2菌株生物膜主要成分含量影响：首先对生物膜样品进行处理，过滤除菌后分别根据需要使用试剂去除样品中的蛋白质、多糖及DNA。首先采用BCA法测量生物膜中总蛋白的含量，即根据已知的蛋白标准品浓度建立标准曲线，推测生物膜中的蛋白浓度；采用核酸荧光染色法测量生物膜中eDNA浓度，即对生物膜中的eDNA染色后测量其荧光值而推断核酸浓度。采用化学发光法测量生物膜中多糖的浓度。分别使用proteinaseK、高碘酸钠和DNaseI对各样本治疗以去除生物膜中的蛋白质、多糖及DNA成分，判断治疗后WT及yoeB基因突变株生物膜的变化。4.亚抑菌浓度抗生素及小檗碱对于金葡菌浮游状态生长及生物膜形成的影响。在96孔板采用二倍稀释法建立各亚抑菌浓度，加入菌液后放入暖箱孵育24小时，观察不同亚抑菌浓度条件下WT及yoeB突变体的生长能力差异。分别使用0.5×MIC、0.25×MIC浓度抗生素对钛棒生物膜诱导并与没有添加抗生素的对照组比较，使用平板稀释法检查各组生物膜CFU的差异；中药黄连有效成分小檗碱对于金葡菌生物膜形成的影响，使用CLSI检测WT及yoeB突变株对小檗碱的MIC，使用10×MIC浓度的小檗碱分别对各组钛棒表面生物膜分别干预，具体方法参照第二部分。
第二部分：建立小鼠肌肉感染模型、皮下植入钛棒周围感染模型及PJI模型。将24只健康的C57BL/6小鼠随机分为WT组、yoeB1突变组和yoeB2突变组。首先建立小鼠肌肉感染模型，细菌定量为1×107CFU/ml，对小鼠大腿备皮消毒后注射100μL菌液，72小时后处死小鼠，取大腿肌肉组织研磨后进行细菌定量分析。皮下植入钛棒感染模型是将无菌的钛棒插入小鼠的皮下，再经切口注射10μL菌液(1×106CFU/ml)造成感染，72小时后取出钛棒进行细菌定量。PJI模型与皮下感染模型类似，内植入物使用3D打印金属材料，手术过程与临床类似，即在无菌条件下切除小鼠半月板及韧带组织，经针头开口后插入涂抹有骨水泥的金属假体，缝合完毕后经关节腔注射10μL菌液(1×106CFU/ml)造成感染，72小时对假体及周围组织细菌进行定量。
结果：
1.yoeB1和yoeB2基因突变株浮游状态下生长速度快于WT，浮游状态下的WT对头孢唑林和万古霉素菌耐药性均强于yoeB基因突变组。Newman的WT株、yoeB1和yoeB2突变株24小时10×MIC头孢唑林和万古霉素生存率分别为0.05%、0.02%、0.02%和0.17%、0.03%、0.08%。JE2的WT株、yoeB1和yoeB2突变株使用10×MIC浓度头孢唑林和万古霉素24小时生存率分别为0.46%、0.03%、0.16%和0.17%、0.02%、0.05%。
2.半定量和定量生物膜分析显示yoeB1和yoeB2基因突变株在96孔板和钛棒表面的生物膜形成能力均小于WT且对抗生素更加敏感。定量分析显示Newman菌株yoeB1和yoeB2基因缺失组生物膜总量分别较WT减少约超过50%，JE2菌株yoeB1和yoeB2基因缺失组生物膜总量分别较WT减少约6倍，Newman的WT、yoeB1和yoeB2突变株在10×MIC浓度头孢唑林和10×MIC浓度万古霉素48小时生存率分别为4.7%、2.2%、1.2%和3.7%、0.4%、0.7%。JE2的WT、yoeB1和yoeB2突变株在10×MIC浓度头孢唑林和10×MIC浓度万古霉素48小时生存率分别为7.2%、0.8%、1.4%和11.4%、7.4%、4.4%
3.生物膜成分分析显示Newman和JE2的生物膜中总蛋白质浓度在WT和yoeB突变株无统计学差异，对WT及yoeB1和yoeB2基因突变株使用蛋白酶K治疗后发现，WT及yoeB基因缺失组均表现为CFU明显降低；生物膜eDNA成分分析表明Newman的yoeB1和yoeB2基因缺失株比WT的EPS中eDNA含量明显降低。使用DNaseI治疗发现WT组的生物膜明显下降而yoeB组无明显变化。JE2菌株的各组eDNA含量无明显差异，使用DNaseI治疗后各组生物膜也无明显变化；生物膜PIA成分分析显示Newman和JE2株的WT组含量明显高于yoeB基因突变组，使用高碘酸钠治疗后发现Newman的WT生物膜总量上升，余组无明显差异。
4.各亚抑菌浓度头孢唑林和万古霉素对Newman和JE2的WT和yoeB突变株浮游状态的生长无明显影响，与不含抗生素的对照组比较无统计学差异。然而，对于Newman的WT使用0.5×MIC诱导后，生物膜总量较PBS组减少，使用0.25×MIC诱导后，生物膜总量较PBS组增加，然而低剂量抗生素诱导生物膜增加的这种现象在yoeB2突变株中消失。进一步分析生物膜的成分发现，低剂量抗生素诱导组生物膜中eDAN含量增加，使用DNaseI治疗后，这种诱导作用消失；小檗碱对两种金葡菌的MIC在WT和yoeB突变株直接无统计学差异，其中Newman的小檗碱MIC为256微克/ml，JE2的小檗碱MIC为128微克/ml，使用10×MIC浓度的小檗碱对两种金葡菌干预后发现，yoeB突变株对小檗碱较WT敏感。Newman和JE2的WT、yoeB1和yoeB2突变株钛棒生物膜在10×MIC浓度小檗碱干预48小时生存率分别为4.2%、1.4%、1.9%和0.9%、0.3%、0.5%。
5.小鼠肌肉感染模型显示JE2菌株的WT组较yoeB突变株具有更强的致病力，WT组小鼠肌肉组织中具有更多的细菌形成，分别是yoeB1和yoeB2突变株的2.4倍和2.5倍。小鼠背部皮下钛棒感染模型也得出了类似的结果，JE2菌株的WT组钛棒表面可粘附更多的细菌,分别是yoeB1和yoeB2组的1.3倍和1.5倍。
结论：
1.删除yoeB基因可以加快Newman和JE2在TSB中的生长，可能是由于删除毒素基因后利于细菌的生长。然而yoeB基因突变株在96孔板及钛棒表面的生物膜形成减少，说明同一基因对于生物膜和浮游细菌可能起到完成不同的作用。进一步的生物膜成分分析显示，yoeB基因参与调节不同的生物膜成分而参与到不同类型生物膜的形成过程中来。化学发光法表明两种菌株的yoeB基因参与细菌生物膜中的PIA的产生，因此删除yoeB基因会减少PIA的形成从而影响PIA依赖性生物膜的形成，同样的，删除Newman菌株中的yoeB基因会降低eDNA的释放，影响了eDNA依赖性生物膜的形成。
2.yoeB基因参与两种菌株对抗生素的耐药，浮游细菌实验及生物膜使用均表现为yoeB突变株降低了对头孢唑林和万古霉素的耐药，使用小檗碱干预两种细菌的生物膜也得出同样类似的结果，说明yoeB基因不但是毒素基因，同样是一种耐药基因，具体该基因如何增加细菌的耐药需要进一步研究。
3.使用0.25×MIC浓度的抗生素对Newman的WT干预后增加了细菌生物膜的形成，成分分析显示该组生物膜中的eDNA含量增加，使用DNaseI干预后这种亚抑菌浓度促使生物膜增加的现象消失，说明亚抑菌浓度抗生素通过增加eDNA依赖型生物膜而增加生物膜的总量。删除yoeB基因可以降低eDNA的产生，因此对于yoeB基因突变株使用亚抑菌浓度干预后没增加该类型生物膜的形成。
4.动物实验得出与体外实验类似结果，说明yoeB不但在体外可以增加细菌生物膜的形成，在动物体内也可发挥该作用。