论文部分内容阅读
文献研究：
糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病人数呈逐年快速攀升的趋势，它已经成为仅次于恶性肿瘤及心脑血管疾病的疾病。根据国际糖尿病联盟(IDF)的预测，2007年全球DM患者大概为2.4亿人，但是到2025年这一数字将增加至3.8亿人。在中国，DM患病率已经从1980年的0.67%上升至2013年的10.4%，患者数量急剧增加。同时，大多数2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者伴有并发症，例如心脑血管疾病及终末期肾病等，这些是导致DM死亡的原因之一，然而慢性并发症的发生及发展给患者的经济及社会都带来了沉重的负担。因此，研究DM的发病机制，发现新的药物作用靶点，研发出高效、无副作用的新药已经成为医药科研工作者亟需解决的问题。
目前认为DM主要的发病病机包括胰岛素的分泌缺陷和胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)两方面。但无论是1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM)还是T2DM，胰岛β细胞的损伤都是DM发生发展的关键环节，它的始动因素可以是来自于遗传也可以是来自环境等方面。相关研究表明，大多数待确诊DM患者的胰岛β细胞可能已经损伤了50%。因此，在DM的发生、发展过程中及时发现胰岛β细胞的损伤，并有效地保护及挽救胰岛β细胞功能，这对DM的预防及治疗显得至关重要。
影响胰岛β细胞功能的因素非常多，其中涉及炎症、内质网应激、氧化应激等。除此之外，自噬亦是影响胰岛β细胞功能重要因素之一。近年随着对细胞自噬的深入研究，自噬也可能是DM发病的重要机制之一。自噬的基本过程：首先是囊泡的形成，它是细胞通过双层膜结构包裹细胞器转化而成；然后再将其运送至溶酶体中降解内容物；最后，对所产生的大分子进行回收利用，此过程的基本目的是为细胞提供代谢所需物质和能量。细胞自噬可以分为非选择性自噬和选择性自噬，这是按照自噬识别的类型进行划分。非选择性自噬，它的主要作用是为细胞提供能量和必需品，该过程往往在营养不足等情况下诱发。相比非选择性自噬，选择性自噬的目的是为了维持细胞稳态，它的作用主要是特异性去除细胞内物质。虽然目前对选择性自噬的研究尚处于初步阶段，但其在机体稳态方面的维持发挥着重要作用，现在已经有更多的科学家把目光聚焦于此。因此，线粒体自噬作为选择性自噬中的一种，因它的独特性而成为线粒体学和细胞自噬研究的热点。相关研究证实，在哺乳动物体内，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬途径较其它分子参与的通路更为经典，并且其通路可能是治疗DM的潜在靶点，它在胰岛细胞中能清除受损线粒体，维持胞内的稳态平衡，从而发挥保护胰岛β细胞的作用。
中医认为现代医学的DM属于“消渴病”的范畴，早在《黄帝内经》中就有相关论述。DM发病往往与饮食不节、禀赋不足、情志失调、劳逸过度、脏腑柔弱等病因关系密切，其病机一般认为是阴虚燥热、脾失健运、肾脏亏虚等。我院伤寒论教研室熊曼琪教授以《伤寒论》为根基，紧扣DM“气阴两虚、瘀热互结”的基本病机，研制出加味桃核承气汤，后续又在此基础之上研制出纯中药的院内制剂——降糖三黄片，以更好地防治DM及其并发症。前期对降糖三黄片的研究取得了丰硕成果，本研究基于既往研究的成果，以线粒体自噬为切入点，探讨降糖三黄片对db/db小鼠胰腺组织中线粒体PINK1/Parkin自噬信号通路的影响，进一步阐明降糖三黄片防治DM的自噬调控作用，以期为该制剂的临床应用及其作用机制的深入研究提供新的理论支撑。
实验研究：
目的：
本研究利用糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)，观察降糖三黄片对db/db小鼠糖、脂代谢水平的影响。基于PINK1/Parkin线粒体自噬通路，通过降糖三黄片与自噬促进剂(雷帕霉素)、模型组、正常组的对比，借助于现代医学的电子显微镜、免疫组化、蛋白质印迹法(Western Blot)等手段，以探讨降糖三黄片保护胰岛细胞的作用机制，为降糖三黄片的临床使用提供实验证据。
方法：
清洁级(SPF级)7～8周龄雄性db/db小鼠及同周龄雄性同窝db/m小鼠分别为40只和10只，db/db小鼠体重介于37.4～45.5g之间，db/m小鼠体重介于19.5g～24.0g之间，购于南京某生物医药研究院。将小鼠喂养在我校动物实验中心的SPF级实验室，湿度和温度分别保持在50%～70%和22℃～24℃之间，保持通风良好，每日光照与黑夜时间各12h交替循环。所有小鼠进行适应性喂养1周之后，db/db小鼠尾尖随机血糖＞16.7mmol/L，并伴有摄食量增加、饮水量增加，则可判断DM模型成立，转入IVC笼内饲养，即可进行接下来的实验。使用随机抽样的方法，把40只db/db小鼠分为降糖三黄片高剂量组、雷帕霉素组、降糖三黄片低剂量组及模型组，每组db/db小鼠各10只。将剩下的10只同周龄并同窝的db/m小鼠设为正常组。各组小鼠正常供水，并给予SPF级饲料(钴60灭菌)喂养。各组给予如下处理：通过人与动物药物剂量换算及标准体重动物与不标准体重动物药物剂量换算。降糖三黄片低剂量组溶液剂量按1.32g/kg?d，每天进行一次灌胃；其相应的高剂量组则按2倍成人量换算，小鼠给药量约合2.64g/kg?d，每日一次灌胃；雷帕霉素组参照药物剂量换算方法，给予1mg/kg?d，每日一次灌胃。降糖三黄片组及雷帕霉素组使用蒸馏水配置成1ml的混悬液，而模型组和正常组分别灌服1ml蒸馏水。每日干预一次，连续干预8周。
分别在干预前、干预的第4周通过尾尖采血，采血前小鼠禁食12小时，但不禁水，以测定空腹血糖。小鼠干预8周后，各组小鼠不禁水，但禁食12小时，然后称重，给予10%的水合氯醛注射小鼠的腹腔行麻醉处理，注射剂量根据小鼠体重按0.5ml/100g的给药量计算。麻醉后进行摘眼球取血，使用一次性真空采血管(促凝管)收集血液，然后使用马克笔编号。采集的血液静置于室温30分钟，之后使用台式低温高速离心机，按照3000rpm的离心速度离心10分钟，最后利用移液枪吸取上清并转移至编号的EP管中，于-20℃冰箱保存，用于后期对糖、脂等代谢指标的检测。剩下的红细胞则另存于新的EP管中，并保存-20℃冰箱中，用于检测糖化血红蛋白(HbA1c)。解剖小鼠，使用钝器摘取胰腺并用PBS液冲洗，手术刀将其切分成三部分。一部分胰腺组织以4%多聚甲醛溶液固定，放置于常温，待做组织病理学检测，用之观察各组小鼠胰腺PINK1、Parkin的染色情况；另一部分胰腺组织使用2.5%的戊二醛中固定，用于做透射电镜的检测，以观察线粒体自噬情况；最后一部分胰腺组织暂置于干冰中留存，后置于-80℃冰箱冻藏，用于WesternBlot检测各组小鼠胰腺PINK1、Parkin、P62蛋白的表达；实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测各组小鼠胰腺PINK1、ParkinmRNA的表达量。
结果：
1.一般情况：实验期间正常组小鼠精神状态良好，毛色有光泽、紧密、整齐，灵活好动，大小便正常，无多饮、多食，体重平稳上升。模型组则精神状态不佳，精神懒惰疲倦，反应迟缓，毛色欠缺光泽，体型较前明显增加，肥胖不好动，饮水及摄食量增加，大便偏硬。使用降糖三黄片和雷帕霉素干预之后，db/db小鼠的饮水量、摄食量和体重等都得到不同程度的改变。实验结束时共死亡4只小鼠，其中降糖三黄片高剂量和低剂量组各死亡1只，雷帕霉素组死亡2只。经过8周干预之后，正常组的体重、日饮水量及日摄食量较实验开始之时，稍有增加，但其增加幅度远低于模型组。在体重方面，实验结束时，降糖三黄片组小鼠体重虽然增加，但是增加幅度小于模型组，且降糖三黄片高剂量组效果优于降糖三黄片低剂量组，它们之间的差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比较，经雷帕霉素干预后，体重出现下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在日摄食方面，模型组db/db小鼠与正常组db/m小鼠对比，模型组小鼠的日摄食量在第4周、第8周增长明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)；干预第8周时，与模型组相比，降糖三黄片高、低剂量组及雷帕霉素摄食量均减少，并且各组之间具有统计学差异(P＜0.05)，但降糖三黄片高剂量组较雷帕霉素组及降糖三黄片低剂量组的日摄食量下降更为明显。在日饮水方面，实验结束时，与模型组相比，降糖三黄片高、低剂量组日饮水量明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且高剂量组下降趋势较低剂量组明显；雷帕霉素组与模型组在第8周时则无明显差异，不具有统计学意义(P＞0.05)；与雷帕霉素组相比，经降糖三黄片不同剂量干预后，其日饮水量均具有统计学意义(P＜0.05)。
2.糖脂代谢及胰岛素抵抗(IR)：在糖代谢方面，正常组的血糖一直保持相对平稳。在实验结束时，模型组的血糖显著升高，且与其相比，降糖三黄片高、低剂量组的空腹血糖(FBG)下降量具有统计学意义(P＜0.05)。雷帕霉素组与模型组相比,它的FBG从第4周到第8周保持相似的变化趋于缓和，且它们之间存在统计学意义(P＜0.05)；在糖化血红蛋白方面(HbA1c)，干预8周之后，各药物干预组的糖化血红蛋白的百分比均高于正常组，降糖三黄片高、低剂量组和雷帕霉素组明显升高(P＜0.05)，但是低于模型组(P＜0.05)；在脂代谢方面，降糖三黄片高剂量组和降糖三黄片低剂量组在降TC、TG、LDL-C方面较模型组降低(P＜0.05)，且降糖三黄片高剂量组和低剂量组之间下降程度差异具有统计学意义(P＜0.05)，降糖三黄片高剂量组下降程度则为更大。雷帕霉素组与模型组相比，虽然雷帕霉素组可见TC、TG及LDL-C有一定幅度地下降，但差异不具统计学意义(P＞0.05)；在空腹胰岛素(FINS)与胰岛素抵抗指数(Homa-IR)方面，与正常组db/m小鼠相比，db/db小鼠血清FINS水平明显增高(P＜0.05)，Homa-IR也同时增加(P＜0.05)。与模型组相比，降糖三黄片高剂量组和降糖三黄片低剂量组小鼠的FINS水平同时下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，并且降糖三黄片高、低剂量组IR得到改善，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但是降糖三黄片高剂量组和低剂量组之间的差异不具统计学意义(P＞0.05)。雷帕霉素组小鼠与模型组相比较，FINS水平下降明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但其下降程度不如降糖三黄片组。与此同时，与模型组相比，雷帕霉素组IR有一定程度下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
3.透射电子显微镜观察小鼠胰腺组织线粒体：通过电镜观察发现，正常组线粒体的数量相对比较多，胞内各细胞器结构清晰，其中部分线粒体肿胀、甚至出现空泡、脊断裂或消失，有小部分线粒体周围出现空泡状双层膜样结构，并形成双层膜包裹的典型自噬体。模型组的小鼠胰腺中线粒体数量相对不足，极少能观察到自噬小体，并且细胞内结构欠清晰。自噬促进剂雷帕霉素组电镜下显示，线粒体出现空泡、肿胀的数量较模型组增多，降糖三黄片高剂量组和低剂量组出现了与之相似的效果。
4.各组小鼠胰腺组织中PINK1、Parkin、P62蛋白的表达情况：(1)免疫组化染色结果显示，与模型组相比，正常组小鼠的胰腺组织中Parkin、PINK1蛋白表达明显增加，着色深，呈黄褐色，表达呈现出强阳性。使用降糖三黄片、雷帕霉素干预之后，Parkin、PINK1蛋白的表达强度增强。对各组进行灰度分析，与模型组相比，正常组、降糖三黄片高剂量组及雷帕霉素组的Parkin及PINK1表达量，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与正常组相比，降糖三黄片高、低剂量组及雷帕霉素组Parkin的表达量，差异不具有统计学意义(P＞0.05)。而降糖三黄片高、低剂量组与正常组比较，其蛋白PINK1的表达差异具有统计学意义(P＜0.05)，雷帕霉素组与正常组比较，PINK1的表达差异不具有统计学意义(P＞0.05)。(2)WesternBlot结果显示，较模型组，正常组、降糖三黄片高、低剂量组及雷帕霉素组小鼠胰腺的Parkin蛋白表达均明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但降糖三黄片高、低剂量组与雷帕霉素组之间的小鼠胰腺Parkin蛋白表达未见明显差异(P＞0.05)。与模型组相比，正常组、降糖三黄片高剂量组及雷帕霉素组小鼠胰腺的PINK1蛋白表达均明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；降糖三黄片剂量组与雷帕霉素组相比，小鼠胰腺PINK1蛋白表达未见明显差异(P＞0.05)。正常组、降糖三黄片高剂量组及雷帕霉素组，与模型组相比，小鼠胰腺的P62蛋白表达均明显减少，且差异具有统计学意义(P＜0.05)；降糖三黄片组与雷帕霉素组相比，小鼠胰腺中P62蛋白表达的表达量未见明显差异(P＞0.05)。
5.各组小鼠胰腺组织中PINK1、ParkinmRNA的表达情况：降糖三黄片高、低剂量组及雷帕霉素组经药物干预8周之后，与模型组相比，小鼠胰腺组织中PINK1、ParkinmRNA表达较模型组升高(P＜0.05)。正常组的PINK1、Parkin表达高于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。降糖三黄片高剂量组与雷帕霉素组的Parkin、PINK1mRNA表达相比，两者相当未见明显差异(P＞0.05)，降糖三黄片高剂量组小鼠胰腺组织中PINK1、ParkinmRNA表达量与降糖三黄片低剂量组的表达量相当(P＞0.05)，但降糖三黄片低剂量组的PINK1、ParkinmRNA表达量低于雷帕霉素组的表达量(P＜0.05)。
结论：
1.降糖三黄片不仅能够改善db/db小鼠的一般状态，如体重、摄食、饮水等，而且还可以降低小鼠的血糖、改善IR，降低HbA1c、TG、TC及LDL-C。
2.降糖三黄片可以增加db/db小鼠胰腺组织的线粒体数量，具有一定延缓胰腺病理损伤的作用。
3.降糖三黄片能够上调db/db小鼠胰腺组织中PINK1、Parkin蛋白的表达，下调P62蛋白的表达。同时，降糖三黄片高剂量组的蛋白表达量与雷帕霉素具有类似的表达趋势；降糖三黄片能够调节db/db小鼠胰腺组织中PINK1、ParkinmRNA的表达，从而调控了线粒体自噬PINK1/Parkin的信号通路，发挥降糖三黄片保护胰岛β细胞的功能。
糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病人数呈逐年快速攀升的趋势，它已经成为仅次于恶性肿瘤及心脑血管疾病的疾病。根据国际糖尿病联盟(IDF)的预测，2007年全球DM患者大概为2.4亿人，但是到2025年这一数字将增加至3.8亿人。在中国，DM患病率已经从1980年的0.67%上升至2013年的10.4%，患者数量急剧增加。同时，大多数2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者伴有并发症，例如心脑血管疾病及终末期肾病等，这些是导致DM死亡的原因之一，然而慢性并发症的发生及发展给患者的经济及社会都带来了沉重的负担。因此，研究DM的发病机制，发现新的药物作用靶点，研发出高效、无副作用的新药已经成为医药科研工作者亟需解决的问题。
目前认为DM主要的发病病机包括胰岛素的分泌缺陷和胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)两方面。但无论是1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM)还是T2DM，胰岛β细胞的损伤都是DM发生发展的关键环节，它的始动因素可以是来自于遗传也可以是来自环境等方面。相关研究表明，大多数待确诊DM患者的胰岛β细胞可能已经损伤了50%。因此，在DM的发生、发展过程中及时发现胰岛β细胞的损伤，并有效地保护及挽救胰岛β细胞功能，这对DM的预防及治疗显得至关重要。
影响胰岛β细胞功能的因素非常多，其中涉及炎症、内质网应激、氧化应激等。除此之外，自噬亦是影响胰岛β细胞功能重要因素之一。近年随着对细胞自噬的深入研究，自噬也可能是DM发病的重要机制之一。自噬的基本过程：首先是囊泡的形成，它是细胞通过双层膜结构包裹细胞器转化而成；然后再将其运送至溶酶体中降解内容物；最后，对所产生的大分子进行回收利用，此过程的基本目的是为细胞提供代谢所需物质和能量。细胞自噬可以分为非选择性自噬和选择性自噬，这是按照自噬识别的类型进行划分。非选择性自噬，它的主要作用是为细胞提供能量和必需品，该过程往往在营养不足等情况下诱发。相比非选择性自噬，选择性自噬的目的是为了维持细胞稳态，它的作用主要是特异性去除细胞内物质。虽然目前对选择性自噬的研究尚处于初步阶段，但其在机体稳态方面的维持发挥着重要作用，现在已经有更多的科学家把目光聚焦于此。因此，线粒体自噬作为选择性自噬中的一种，因它的独特性而成为线粒体学和细胞自噬研究的热点。相关研究证实，在哺乳动物体内，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬途径较其它分子参与的通路更为经典，并且其通路可能是治疗DM的潜在靶点，它在胰岛细胞中能清除受损线粒体，维持胞内的稳态平衡，从而发挥保护胰岛β细胞的作用。
中医认为现代医学的DM属于“消渴病”的范畴，早在《黄帝内经》中就有相关论述。DM发病往往与饮食不节、禀赋不足、情志失调、劳逸过度、脏腑柔弱等病因关系密切，其病机一般认为是阴虚燥热、脾失健运、肾脏亏虚等。我院伤寒论教研室熊曼琪教授以《伤寒论》为根基，紧扣DM“气阴两虚、瘀热互结”的基本病机，研制出加味桃核承气汤，后续又在此基础之上研制出纯中药的院内制剂——降糖三黄片，以更好地防治DM及其并发症。前期对降糖三黄片的研究取得了丰硕成果，本研究基于既往研究的成果，以线粒体自噬为切入点，探讨降糖三黄片对db/db小鼠胰腺组织中线粒体PINK1/Parkin自噬信号通路的影响，进一步阐明降糖三黄片防治DM的自噬调控作用，以期为该制剂的临床应用及其作用机制的深入研究提供新的理论支撑。
实验研究：
目的：
本研究利用糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)，观察降糖三黄片对db/db小鼠糖、脂代谢水平的影响。基于PINK1/Parkin线粒体自噬通路，通过降糖三黄片与自噬促进剂(雷帕霉素)、模型组、正常组的对比，借助于现代医学的电子显微镜、免疫组化、蛋白质印迹法(Western Blot)等手段，以探讨降糖三黄片保护胰岛细胞的作用机制，为降糖三黄片的临床使用提供实验证据。
方法：
清洁级(SPF级)7～8周龄雄性db/db小鼠及同周龄雄性同窝db/m小鼠分别为40只和10只，db/db小鼠体重介于37.4～45.5g之间，db/m小鼠体重介于19.5g～24.0g之间，购于南京某生物医药研究院。将小鼠喂养在我校动物实验中心的SPF级实验室，湿度和温度分别保持在50%～70%和22℃～24℃之间，保持通风良好，每日光照与黑夜时间各12h交替循环。所有小鼠进行适应性喂养1周之后，db/db小鼠尾尖随机血糖＞16.7mmol/L，并伴有摄食量增加、饮水量增加，则可判断DM模型成立，转入IVC笼内饲养，即可进行接下来的实验。使用随机抽样的方法，把40只db/db小鼠分为降糖三黄片高剂量组、雷帕霉素组、降糖三黄片低剂量组及模型组，每组db/db小鼠各10只。将剩下的10只同周龄并同窝的db/m小鼠设为正常组。各组小鼠正常供水，并给予SPF级饲料(钴60灭菌)喂养。各组给予如下处理：通过人与动物药物剂量换算及标准体重动物与不标准体重动物药物剂量换算。降糖三黄片低剂量组溶液剂量按1.32g/kg?d，每天进行一次灌胃；其相应的高剂量组则按2倍成人量换算，小鼠给药量约合2.64g/kg?d，每日一次灌胃；雷帕霉素组参照药物剂量换算方法，给予1mg/kg?d，每日一次灌胃。降糖三黄片组及雷帕霉素组使用蒸馏水配置成1ml的混悬液，而模型组和正常组分别灌服1ml蒸馏水。每日干预一次，连续干预8周。
分别在干预前、干预的第4周通过尾尖采血，采血前小鼠禁食12小时，但不禁水，以测定空腹血糖。小鼠干预8周后，各组小鼠不禁水，但禁食12小时，然后称重，给予10%的水合氯醛注射小鼠的腹腔行麻醉处理，注射剂量根据小鼠体重按0.5ml/100g的给药量计算。麻醉后进行摘眼球取血，使用一次性真空采血管(促凝管)收集血液，然后使用马克笔编号。采集的血液静置于室温30分钟，之后使用台式低温高速离心机，按照3000rpm的离心速度离心10分钟，最后利用移液枪吸取上清并转移至编号的EP管中，于-20℃冰箱保存，用于后期对糖、脂等代谢指标的检测。剩下的红细胞则另存于新的EP管中，并保存-20℃冰箱中，用于检测糖化血红蛋白(HbA1c)。解剖小鼠，使用钝器摘取胰腺并用PBS液冲洗，手术刀将其切分成三部分。一部分胰腺组织以4%多聚甲醛溶液固定，放置于常温，待做组织病理学检测，用之观察各组小鼠胰腺PINK1、Parkin的染色情况；另一部分胰腺组织使用2.5%的戊二醛中固定，用于做透射电镜的检测，以观察线粒体自噬情况；最后一部分胰腺组织暂置于干冰中留存，后置于-80℃冰箱冻藏，用于WesternBlot检测各组小鼠胰腺PINK1、Parkin、P62蛋白的表达；实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测各组小鼠胰腺PINK1、ParkinmRNA的表达量。
结果：
1.一般情况：实验期间正常组小鼠精神状态良好，毛色有光泽、紧密、整齐，灵活好动，大小便正常，无多饮、多食，体重平稳上升。模型组则精神状态不佳，精神懒惰疲倦，反应迟缓，毛色欠缺光泽，体型较前明显增加，肥胖不好动，饮水及摄食量增加，大便偏硬。使用降糖三黄片和雷帕霉素干预之后，db/db小鼠的饮水量、摄食量和体重等都得到不同程度的改变。实验结束时共死亡4只小鼠，其中降糖三黄片高剂量和低剂量组各死亡1只，雷帕霉素组死亡2只。经过8周干预之后，正常组的体重、日饮水量及日摄食量较实验开始之时，稍有增加，但其增加幅度远低于模型组。在体重方面，实验结束时，降糖三黄片组小鼠体重虽然增加，但是增加幅度小于模型组，且降糖三黄片高剂量组效果优于降糖三黄片低剂量组，它们之间的差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比较，经雷帕霉素干预后，体重出现下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在日摄食方面，模型组db/db小鼠与正常组db/m小鼠对比，模型组小鼠的日摄食量在第4周、第8周增长明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)；干预第8周时，与模型组相比，降糖三黄片高、低剂量组及雷帕霉素摄食量均减少，并且各组之间具有统计学差异(P＜0.05)，但降糖三黄片高剂量组较雷帕霉素组及降糖三黄片低剂量组的日摄食量下降更为明显。在日饮水方面，实验结束时，与模型组相比，降糖三黄片高、低剂量组日饮水量明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且高剂量组下降趋势较低剂量组明显；雷帕霉素组与模型组在第8周时则无明显差异，不具有统计学意义(P＞0.05)；与雷帕霉素组相比，经降糖三黄片不同剂量干预后，其日饮水量均具有统计学意义(P＜0.05)。
2.糖脂代谢及胰岛素抵抗(IR)：在糖代谢方面，正常组的血糖一直保持相对平稳。在实验结束时，模型组的血糖显著升高，且与其相比，降糖三黄片高、低剂量组的空腹血糖(FBG)下降量具有统计学意义(P＜0.05)。雷帕霉素组与模型组相比,它的FBG从第4周到第8周保持相似的变化趋于缓和，且它们之间存在统计学意义(P＜0.05)；在糖化血红蛋白方面(HbA1c)，干预8周之后，各药物干预组的糖化血红蛋白的百分比均高于正常组，降糖三黄片高、低剂量组和雷帕霉素组明显升高(P＜0.05)，但是低于模型组(P＜0.05)；在脂代谢方面，降糖三黄片高剂量组和降糖三黄片低剂量组在降TC、TG、LDL-C方面较模型组降低(P＜0.05)，且降糖三黄片高剂量组和低剂量组之间下降程度差异具有统计学意义(P＜0.05)，降糖三黄片高剂量组下降程度则为更大。雷帕霉素组与模型组相比，虽然雷帕霉素组可见TC、TG及LDL-C有一定幅度地下降，但差异不具统计学意义(P＞0.05)；在空腹胰岛素(FINS)与胰岛素抵抗指数(Homa-IR)方面，与正常组db/m小鼠相比，db/db小鼠血清FINS水平明显增高(P＜0.05)，Homa-IR也同时增加(P＜0.05)。与模型组相比，降糖三黄片高剂量组和降糖三黄片低剂量组小鼠的FINS水平同时下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，并且降糖三黄片高、低剂量组IR得到改善，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但是降糖三黄片高剂量组和低剂量组之间的差异不具统计学意义(P＞0.05)。雷帕霉素组小鼠与模型组相比较，FINS水平下降明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但其下降程度不如降糖三黄片组。与此同时，与模型组相比，雷帕霉素组IR有一定程度下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
3.透射电子显微镜观察小鼠胰腺组织线粒体：通过电镜观察发现，正常组线粒体的数量相对比较多，胞内各细胞器结构清晰，其中部分线粒体肿胀、甚至出现空泡、脊断裂或消失，有小部分线粒体周围出现空泡状双层膜样结构，并形成双层膜包裹的典型自噬体。模型组的小鼠胰腺中线粒体数量相对不足，极少能观察到自噬小体，并且细胞内结构欠清晰。自噬促进剂雷帕霉素组电镜下显示，线粒体出现空泡、肿胀的数量较模型组增多，降糖三黄片高剂量组和低剂量组出现了与之相似的效果。
4.各组小鼠胰腺组织中PINK1、Parkin、P62蛋白的表达情况：(1)免疫组化染色结果显示，与模型组相比，正常组小鼠的胰腺组织中Parkin、PINK1蛋白表达明显增加，着色深，呈黄褐色，表达呈现出强阳性。使用降糖三黄片、雷帕霉素干预之后，Parkin、PINK1蛋白的表达强度增强。对各组进行灰度分析，与模型组相比，正常组、降糖三黄片高剂量组及雷帕霉素组的Parkin及PINK1表达量，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与正常组相比，降糖三黄片高、低剂量组及雷帕霉素组Parkin的表达量，差异不具有统计学意义(P＞0.05)。而降糖三黄片高、低剂量组与正常组比较，其蛋白PINK1的表达差异具有统计学意义(P＜0.05)，雷帕霉素组与正常组比较，PINK1的表达差异不具有统计学意义(P＞0.05)。(2)WesternBlot结果显示，较模型组，正常组、降糖三黄片高、低剂量组及雷帕霉素组小鼠胰腺的Parkin蛋白表达均明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但降糖三黄片高、低剂量组与雷帕霉素组之间的小鼠胰腺Parkin蛋白表达未见明显差异(P＞0.05)。与模型组相比，正常组、降糖三黄片高剂量组及雷帕霉素组小鼠胰腺的PINK1蛋白表达均明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；降糖三黄片剂量组与雷帕霉素组相比，小鼠胰腺PINK1蛋白表达未见明显差异(P＞0.05)。正常组、降糖三黄片高剂量组及雷帕霉素组，与模型组相比，小鼠胰腺的P62蛋白表达均明显减少，且差异具有统计学意义(P＜0.05)；降糖三黄片组与雷帕霉素组相比，小鼠胰腺中P62蛋白表达的表达量未见明显差异(P＞0.05)。
5.各组小鼠胰腺组织中PINK1、ParkinmRNA的表达情况：降糖三黄片高、低剂量组及雷帕霉素组经药物干预8周之后，与模型组相比，小鼠胰腺组织中PINK1、ParkinmRNA表达较模型组升高(P＜0.05)。正常组的PINK1、Parkin表达高于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。降糖三黄片高剂量组与雷帕霉素组的Parkin、PINK1mRNA表达相比，两者相当未见明显差异(P＞0.05)，降糖三黄片高剂量组小鼠胰腺组织中PINK1、ParkinmRNA表达量与降糖三黄片低剂量组的表达量相当(P＞0.05)，但降糖三黄片低剂量组的PINK1、ParkinmRNA表达量低于雷帕霉素组的表达量(P＜0.05)。
结论：
1.降糖三黄片不仅能够改善db/db小鼠的一般状态，如体重、摄食、饮水等，而且还可以降低小鼠的血糖、改善IR，降低HbA1c、TG、TC及LDL-C。
2.降糖三黄片可以增加db/db小鼠胰腺组织的线粒体数量，具有一定延缓胰腺病理损伤的作用。
3.降糖三黄片能够上调db/db小鼠胰腺组织中PINK1、Parkin蛋白的表达，下调P62蛋白的表达。同时，降糖三黄片高剂量组的蛋白表达量与雷帕霉素具有类似的表达趋势；降糖三黄片能够调节db/db小鼠胰腺组织中PINK1、ParkinmRNA的表达，从而调控了线粒体自噬PINK1/Parkin的信号通路，发挥降糖三黄片保护胰岛β细胞的功能。