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EphA3是一个新发现的基因,目前关于它的文献报道得较少。我们实验室在研究前列腺癌相关基因PC-1的时候发现EphA3的表达与PC-1基因的表达有相关性,这种相关性提示我们,EphA3可能在前列腺癌的发生发展中起一定作用。
因此,为了验证我们的推测,按照常规的研究思路,构建了pcDNA3.1(-)/myc-his-EphA3的真核表达载体,通过稳定转染将其导入成纤维细胞NIH3T3中建立稳定的NIH3T3-EphA3、NIH3T3-null的细胞克隆,然后通过MTT、平板克隆实验、软琼脂集落形成实验初步证明EphA3的高表达可以显著提高前列腺癌的克隆形成能力和锚着非依赖生长能力,即可促进前列腺癌的恶性转化。
而且,为了证明EphA3基因是否能象PC-1一样极显著的促进前列腺癌细胞的恶性转化,即证明EphA3基因是否为真正的前列腺癌正相关基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1-EphA3-IRES-PC-1,并通过稳定转染前列腺癌细胞获得了高表达EphA3、PC-1的LNCaP-EphA3、LNCaP-PC-1的稳定细胞克隆,以及同时稳定表达EphA3和PC-1的LNCaP-EphA3-PC-1细胞克隆。
稳定的细胞克隆通过平板克隆实验、软琼脂集落形成实验、裸鼠成瘤实验,初步证明EphA3、PC-1的高表达均可以显著提高前列腺癌的克隆形成能力和锚着非依赖生长能力,以及导致裸鼠体内成瘤。即EphA3具有与PC-1相似的功能。
另外,构建了九个用于进行蛋白质相互作用实验的融合表达载体(带GST标签),即pGEX-KG-SGEF-CDS全长,pGEX-KG-SGEF-DPS,pGEX-KG-SGEF-DP,pGEX-KG-SGEF-PS,pGEX-KG-SGEF-D,pGEX-KG-SGEF-P,pGEX-KG-SGEF-S,pGEX-KG-SGEF同源,pGEX-KG-CSGEF。并成功诱导其中的四个载体表达出GST融合蛋白,可以用于随后的蛋白质相互作用实验。