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肺动脉高压是一种恶性程度很高的心血管疾病，其病因和发病机制未明。大量研究表明，缺氧在肺动脉高压的病理生成中具有重要作用。缺氧性肺血管收缩和肺血管重构是肺动脉高压的两个主要病理过程。尤其是肺血管重构，至今仍无有效药物进行逆转，所以迫切需要对肺动脉高压和肺血管重构病理机制进行深入探索。肺血管重构主要包括肺血管新生和肺动脉中层增厚两个病理过程。其中肺动脉中层增厚主要由肺动脉平滑肌细胞凋亡抑制和增殖过度引起。关于肺动脉平滑肌细胞增殖的研究已有大量报道，本论文从细胞凋亡的角度探讨肺血管重构的分子机理。20-羟基-二十碳四烯酸(20-HETE)是花生四烯酸经细胞色素P4504A代谢的产物，在肺循环主要分布于血管内皮，而在体循环主要分布于血管平滑肌。20-HETE在肺循环分布的组织特异性提示20-HETE可能同肺动脉高压和肺血管重构的发生发展有关。肺动脉平滑肌细胞的凋亡是肺血管重构的一个关键步骤，而20-HETE对肺血管平滑肌细胞凋亡的作用以及其中的凋亡相关途径至今无人报道。
目的:研究20-HETE对牛肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)凋亡的抑制效应及其相关分子机制。
方法:本实验首先采用细胞活力测定(MTT和LDH释放)观察20-HETE是否影响肺动脉平滑肌细胞生长。采用hoechst核染色、Annexin V/PI结合测定、TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)三种凋亡指标观察20-HETE是否抑制肺动脉平滑肌细胞凋亡。采用线粒体电势测定、抗凋亡蛋白bcl-2表达定量观察20-HETE对肺动脉平滑肌细胞线粒体通透性的影响。采用western blot和caspase蛋白活性测定观察20-HETE对肺动脉平滑肌细胞caspase家族蛋白表达和活性的影响。采用花生四烯酸经15-脂氧酶的代谢产物15-羟基一二十碳四烯酸(15-HETE)对比观察20-HETE在众多类花生四烯酸中对于肺动脉平滑肌细胞的凋亡抑制效应是否具有特异性。采用细胞活力测定以及不同信号转导途径的特异抑制剂确定参与20-HETE抑制肺动脉平滑肌细胞凋亡的具体细胞转导途径。
结果:外源性20-HETE抑制血清饥饿诱导的牛肺动脉平滑肌细胞活力下降，并呈剂量依赖性。20-HETE缓解血清饥饿引起的肺动脉平滑肌细胞染色质凝聚、DNA缺口末端标记以及annexin-V对此细胞的结合。这种效应可被20-HETE内源性抑制剂17-ODYA反转。而且，20-HETE诱导bcl-2表达，缓解血清饥饿诱导的肺动脉平滑肌细胞线粒体电势脱极化，维持线粒体膜稳定性。20-HETE还可缓解caspase-9和caspase-3分裂活化。上述效应可被17-ODYA逆转。相比之下，花生四烯酸另一代谢产物15-HETE虽然可以促进肺动脉平滑肌细胞中bcl-2表达，但是细胞活力测定表明20-HETE对于肺动脉平滑肌细胞的保护作用强于15-HETE。两种信号转导途径ERK和ROCK的化学抑制剂U0126和Y27632均可抑制20-HETE对于肺动脉平滑肌细胞的保护作用。
结论:20-HETE通过促进bcl-2表达维持线粒体膜稳定性、通过缓解caspase-9和caspase-3的分裂活化抑制PASMCs凋亡，此效应可能同ERK和ROCK信号转导途径有关。20-HETE可能是一种调节肺血管重构的重要分子。