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树鼩作为新兴的医学实验动物之一,因其在进化地位上与灵长类动物较为接近,体型小,繁殖快,易驯养和饲育,以及存在诸多自发性疾病等特性,可作为某些人类重大疾病研究的动物模型,在医学生物学上已呈现出广泛的应用前景。目前,树鼩已被应用于病毒、神经、免疫、肿瘤和神经性疾病的研究,但表现出对其应用研究多于基础研究的状态,遗传背景研究就更为少见,不利于实现树鼩实验动物标准化。微卫星是近十几年来发展起来的一种新的分子标记,它是指以少数几个核苷酸(1～6个)为单位多次重复的简单序列。由于微卫星遗传标记具有数量大、分布广且均匀、多态信息含量高、检测快速以及适合自动化分析等优点,已被广泛用于动植物基因图谱的构建、标记辅助选择、亲缘关系鉴定、遗传多样性评估及系统进化树的构建等。然而,当前树鼩的微卫星分子标记还很少,因此,筛选出可以应用的微卫星位点是一项非常基础和重要的工作。本研究通过构建树鼩小片段插入文库,利用地高辛标记(AC)15序列作为探针,筛选树鼩微卫星位点,丰富了中缅树鼩的特异性遗传标记,为进一步筛选大量的树鼩微卫星遗传标记奠定了基础,也为开展树鼩繁育工作与实现实验动物标准化提供一定的理论基础和遗传检测方法。
提取树鼩总DNA,限制性内切酶Sau3AⅠ酶切,回收300～1000 bp之间的片段,连接质粒,转化入Top10感受态细胞中,蓝白斑筛选后培养扩增,建立中缅树鼩基因小片段插入文库。利用5’端地高辛标记的(AC)15探针进行菌落原位杂交,从约1500个菌落中选出36个阳性克隆。对这些克隆进行测序,发现其中15个含有重复序列,其中1个为重复克隆,1个因两端序列太短而不能设计引物。用Primer3软件设计13对引物。对树鼩种群进行PCR验证引物有效性,13对引物均有条带。退火温度分布在44℃到52℃之间。阳性克隆率为2.4％,微卫星克隆率为1％。本研究所使用的地高辛标记探针筛选树鼩微卫星分子标记所得的微卫星克隆率,可达到传统放射性同位素标记探针同等的效果,并可避免放射性危害。树鼩微卫星分子标记的筛选将为下一步进行基因组结构的分析、树鼩遗传连锁图谱的构建、分子进化和标记辅助选择等提供大量的微卫星标记。
为了进一步研究中缅树鼩微卫星位点多态性特征,结合微卫星DNA标记具有高度的多态性、共显性遗传、易于PCR稳定扩增等特点,用新筛选的13个微卫星座位对32只中缅树鼩进行PCR扩增及12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测微卫星DNA的扩增产物,并计算其等位基因数、等位基因频率、多态性信息含量(PIC)、基因杂合度等指标。13个微卫星基因座共检测到77个等位基因,平均等位基因数为5.9231。TBC13座位的杂期望合度值(He)最高,为0.8646,最低为TBC11的0.5060,平均期望杂合度为0.7894。各微卫星座位的多态信息含量值(PIC)在0.3740～0.8324之间,平均值为0.7396,表明该树鼩种群具有较高的遗传多样性。结果表明,筛选的13个微卫星基因座具有较丰富的遗传多态性,可用于中缅树鼩的遗传多样性分析。
研究表明,该树鼩种群具有较丰富的遗传多态性；本研究建立树鼩小片段插入基因组文库,筛选出13个微卫星位点,并对这些位点进行了特征分析和多态性评估。多态性较高的树鼩种群有利于动物的繁殖育种,但要广泛应用于生物医学研究中还需要进一步推进实验动物标准化进程,以保证实验结果的一致性和可靠性。