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Ran(Ras-relatednuclearprotein)蛋白是小G蛋白家族成员之一,具有调控多种生命活动进程的作用。Ran蛋白与相关蛋白质包括RanGAP、RanBP和RanGEF以及蛋白质转运因子importingα、importingβ等共同作用,调控细胞有丝分裂末期核膜重建的进程。迄今为止,还没有关于植物中Ran基因对核膜重建进程作用的报道。
在本项研究中,从拟南芥cDNA表达文库中克隆得到了拟南芥Ran家族成员AtRanl的cDNA全长序列,并制备了其点突变体AtRanlT27N和AtRanlQ72L,原核表达了GST-AtRanl、GST-AtRanlT27N和GST-AtRanlQ72L等融合蛋白。利用这些融合蛋白研究了ArRanl在体外非细胞体系中对核膜重建进程的作用。结果发现,在非洲爪蟾卵细胞提取物和水稻悬浮细胞提取物中,AtRanl都能促进膜性成分的募集和核孔复合体蛋白质的富集,并能在爪蟾卵细胞提取物中诱导膜泡累积、融合形成类似双层膜的结构,而突变体蛋白只能募集膜泡到Beads表面。
应用基因枪法瞬时转化和农杆菌介导的稳定转化技术,研究发现,AtRanl蛋白在瞬时表达和稳定表达时都特异性的定位于细胞核中和核膜上。以稳定表达AtRanl的烟草BY-2细胞系为材料的研究还发现AtRanl可以促进处于有丝分裂期细胞数目的增多。
AtRanl基因表达水平的改变影响了拟南芥的生长发育。过表达AtRanl可以促进拟南芥营养生长,使莲座叶数目增多、叶片变大、增厚以及着生次序紊乱,并延长营养生长时期,推迟开花时间;随着拟南芥的生长发育,过表达AtRanl明显抑制开花后主茎和侧枝顶端优势的形成,促进侧枝发育,并造成原顶端位置花序的败育,并延长整个生长周期。在根系发育中,过表达AtRanl使主根长度显著增长和侧根数目显著增加。抑制AtRanl的表达后,拟南芥开花时间提前,侧根数目显著减少,其他发育情况正常。
根据以上结果,本文认为AtRanl蛋白可以在体外非细胞体系中促进核膜重建,并且可以影响细胞有丝分裂进程,而这些功能的发挥可能是与其在细胞核中和核膜上的定位相联系的。在拟南芥中,AtRanl基因表达的改变可能通过对细胞分裂活动的作用而影响拟南芥的早期细胞分化,使植株在随后生长发育过程中表现出一系列表型。