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水稻细胞质雄性不育系统是水稻杂种优势利用的重要工具.水稻中已发现有多种细胞质雄性不育系统.本论文对水稻红莲型雄性不育恢复基因的克隆及其与不育基因分子作用机理进行了研究.内容包括:对恢复基因Rf-6进行了精细定位,确定候选基因;利用前人的研究结果及数据库的序列信息遴选Rf-5候选基因;对候选基因进行功能互补实验;对红莲型细胞质雄性不育的育性恢复分子机理进行初步探讨,以及对红莲型和包台型细胞质雄性不育基因的起源进行研究.本研究主要结果如下:
1.采用粤泰A(YT-A,不育系)×93-11(恢复系)组合的自交F2代群体,观察190株F2个体的花粉育性分离情况,发现全可育株为102株,半不育株为88株.经过x2检验其分离比例符合1:1.利用侧翼标记分析法筛选了大约2000株F2个体,再进一步的设计和开发新的分子标记,将Rf-6的候选基因精细定位在BAC克隆OSJNBa0041P03上的orf8处.
2.orf8编码一个791个氨基酸的多肽,在结构上具有18个PPR的结构域,RGP网站预测,N端具有线粒体定位信号.测序分析表明,93-11和粤泰A在编码区存在3个SNP,其中两个为无义突变,另一个在距离起始密码1839bp处,导致粤泰A编码的ORF8第614个氨基酸从亮氨酸(Leu)突变为异亮氨酸(Ile).
3.利用前人Rf-5的初步定位结果和通过对目标区的粤泰A和恢复系密阳23的基因组测序分析,初步确定了Rf-5的候选基因orf5.
4.orf5编码一个683个氨基酸的多肽,在结构上具有16个PPR的结构域,RGP网站预测,N端具有线粒体定位信号.
5.为通过功能互补试验确认ORF8及ORF5的功能,构建了植物转化载体pCAMBIA1305-ORF8和pCAMBIA1305-ORF5,用以转化保持系粳稻品种中花11,已获得转化苗,拟将其与不育系粤泰A杂交,对其后代进行育性观察.
6.对Rf-5和Rf-6与已报道的红莲型细胞质雄性不育系特有的转录本H-atp6/orfH79相互作用的分子机理进行研究.对粤泰A中N-atp6、H-atp6/orfH79转录本的5和3末端以及被切割加工的orfH79的5末端进行分析。发现了Rf-5参与对H-atp6/orfH79转录本的剪切位点与Rf1a口的作用位点不同.Rf-6以某种转录后调控机制介导整个H-atp6/orfH79基因的转录本的降解.这两种不同的作用模式都使不育基因orfH79的毒性完全解除,从而恢复花粉育性.研究中还发现红莲型不育系粤泰A中也存在包台型的Rfla口对H-atp6/orfH79 mRNA类似的剪切加工.
7.采用hiTail-PCR的方法对包台型不育系KFA的orf79旁翼序列进行扩增和测序.结果表明,B-atp6/orf79与正常的N-atp6拷贝是以反向串联重复的方式在线粒体基因组上排列,证明了包台型的B-atp6与红莲型的H-atp6在线粒体基因组中有类似的结构,表明这2种细胞质雄性不育基因有共同的起源关系.
8.对亚洲栽培稻(O.sativa)、非洲栽培稻(O.glaberrima)和23个种的野生稻共342份材料进行PCR筛查,发现了20份材料中有atp6/orf79的同源基因.对其中18份普通野生稻材料和1份斑点野生稻材料进行了测序,发现在atp6和orf79的间隔区有较大的变异.根据其相似程度,可将它们分为3群,即包台型群、红莲型群、和一个新的群.进一步对亚洲栽培稻(O.sativa)和20个种的野生稻共572份材料进行PCR筛查,在17份亚洲栽培稻材料和其中的10种野生稻共40份材料中都能检测到orf79的同源基因.说明orf79是起源比较早的基因.
本研究结果对阐明红莲型细胞质雄性不育恢复性的分子机理以及orf79的起源进化打下了基础,对培育新的细胞质雄性不育系具有重要的理论和应用价值.