论文部分内容阅读
心血管疾病占全球疾病死亡率的第一位，占疾病死亡的40%以上，其中心肌梗死(myocardial infarction, MI)约占20%以上。在我国，《中国心血管病报告2017》显示，我国心血管疾病患者人数约2.9亿，每年死亡人数约400万；预测未来10年患病率仍将快速上升，已经成为危害人类健康的重大的公共卫生问题。MI引起心肌细胞缺血性坏死，心肌细胞再生能力极弱，死亡的心肌细胞引起周围成纤维细胞增生并分泌大量胶原纤维造成心肌纤维化，最终引起心室重构、心功能下降甚至心力衰竭。骨髓源性干细胞自发性招募进入心肌梗死区修复坏死心肌的效果很低；药物和手术治疗可以一定程度拯救频临死亡的心肌，但对坏死的心肌没有作用、不能逆转心室重构及改善心功能障碍，因此不能阻止MI进展和降低死亡率。因此，有效修复心脏损伤对于提高MI患者的预后至关重要。以细胞为基础的心肌组织再生是目前最有前景的治疗选择。干细胞因其很强的自我更新能力和分化潜能，成为最具治疗潜能的细胞系。
成体干细胞不存在胚胎干细胞引发的伦理争议和诱导多能干细胞存在的基因不稳定的困扰，使其成为细胞再生医学领域的理想细胞系。成体干细胞中的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有容易获取，低免疫原性，易于外源基因导入等优点，成为再生医学中应用最广泛的种子细胞。临床前期研究表明，移植到梗死心肌部位的BMSCs能够促进血管再生改善心肌缺血微环境，缩小了梗死面积，不同程度地改善了心功能不全。但是，2006年到2016年的一期和二期临床Meta分析显示，移植BMSCs对心脏功能的改善有限或者没有效果，其中最主要的瓶颈问题是移植体内的BMCSs存活力低、保留下来的BMSCs改善心功能的有效性低。
因此，研发新的策略以显著提高干细胞修复心脏损伤的效果显得尤为重要。临床前期研究表明，基因修饰具有多模式性、能覆盖干细胞治疗的几个挑战性问题，基因与细胞治疗相结合成为提高干细胞治疗效率的有效途径。基因修饰可以通过提高干细胞的旁分泌功能促进血管再生、提高移植干细胞存活率和归巢，可以高效、靶向传递治疗性基因产物，进而增强干细胞修复损伤的效果。BMSCs具有易于获得；体外扩增10亿倍或更多倍数时干细胞的多向分化潜力仍然保持；外源基因较易于转入，并容易和BMSCs的基因组整合，稳定表达蛋白，而BMSCs的特性不受影响；具有较强的端粒酶活性、旁分泌功能等优势，使BMSCs成为基因治疗的良好载体。
脊椎顶板蛋白1(Roof plate-specific spondin 1，R-spondin 1，Rspo1)属于Rspo分泌蛋白家族成员之一，Rspo1作为Wnt/β-catenin信号通路的激活剂可放大经典/非经典Wnt/β-catenin信号通路。研究显示，基因Rspo1通过维持干细胞的干性特征参与组织正常形态的发生；Rspo1对胃肠道和口腔黏膜上皮干细胞通过促进其增殖、抑制其凋亡修复损伤的黏膜；小鼠肠缺血再灌注损伤后肠道内分泌细胞通过基因Rspo1表达上调，以旁分泌方式激活Wnt/β-catenin信号通道，促进肠道上皮干细胞增殖并分化为肠道上皮从而修复受损的肠道上皮；Rspo1蛋白促进成骨细胞分化成熟增加骨形成，缓减骨关节炎的损害；Rspo1蛋白促进糖尿病小鼠的胰岛β-细胞修复和再生。研究还显示，Rspo1作为血管生成因子可以促进血管生成，2011年Gore研究发现，基因Rspo1通过激活Wnt-Vegfc-Vegfr3信号通路使斑马鱼胚胎血管内皮细胞增生并以出芽方式促进血管发生(angiogenesis)。Rspo1促进皮肤血管生成。Rspo1存在于睾丸形态发生的所有阶段，在睾丸血管发生的主要组分睾丸体腔上皮表达，作为胚胎睾丸分泌的血管生成因子通过PDGF-b基因表达调控睾丸的血管发生。Rspo1通过Wnt-Vegfc-Vegfr3信号通路在肿瘤血管发生中也起重要作用。上述研究提示，基因Rspo1在成体干细胞的增殖、分化、干性维持和血管发生中起促进作用。然而，基因Rspo1对BMSCs的生存能力、分化潜能以及提高BMSCs改善心脏损伤的效应目前尚无报导。
课题组前期研究结果显示，大鼠心脏发育畸形和正常心脏组织经IlluminaHiSeqTM2000高通量测序，基因Rspo1表达明显下调；Rspo1蛋白在大鼠心肌梗死区表达下调。结果提示，基因Rspo1可能在心脏损伤中发挥作用，基此本课题的研究内容如下：
首先，我们以腺病毒为载体将Rspo1转染大鼠BMSCs使BMSCs高表达Rspo1，通过观察Rspo1对BMSCs凋亡、增殖和分化的作用，研究Rspo1对BMSCs生存能力和分化能力的影响。结果显示，与BMSCs组和阴性对照BMSCs-GFP组相比较，表达Rspo1的BMSCs的增殖增加、凋亡下降以及向心肌样细胞的分化能力增强，表明Rspo1可以增强BMSCs的生存能力和分化能力。
第二，在Rspo1细胞水平可以增强BMSCs的生存和分化能力基础上，在体水平研究心肌移植表达Rspo1的BMSCs对MI大鼠心肌损伤的修复效应。结果显示，与单纯移植BMSCs相比较，Rspo1能够提高移植BMSCs的移植存活率，Rspo1通过促进梗死区微血管再生、减小心肌梗死面积以及抑制心肌损伤部位细胞的凋亡，提高了BMSCs修复损伤心脏的心功能。
第三，基因修饰通过增强BMSCs旁分泌生物活性分子，在提高BMSCs修复受损心脏的效应中发挥重要作用。其中，基因通过增加干细胞分泌血管生成因子促进新生血管的形成，增加心肌梗死区的血流灌注，改善移植干细胞生存的缺氧微环境，在增强干细胞修复心脏损伤中作用关键。基此，我们采用同重同位素标记定量(IBT)质谱技术，对表达基因Rspo1的BMSCs进行蛋白质定量分析，筛选促血管生成因子中表达差异最大的因子，并分析该因子发挥促进血管再生作用的可能信号通路。结果发现，Rspo1增强BMSCs修复损伤心脏的作用可能与Rspo1增加BMSCs分泌血管成因子Dock4和CollagenⅣ-α3进而促进血管再生有关。Dock4可能通过Rap1信号通路在Rspo1促进血管再生过程中发挥关键作用；CollagenⅣ-α3作为血管基膜的组分，通过细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和受体整合素(Integrin)家族中的VLA蛋白相互作用信号通路在血管再生过程的血管基膜组装中发挥作用。
总之，本课题研究表明，基因Rspo1通过提高BMSC的移植存活率以及通过增加BMSCs旁分泌血管生成因子促进血管再生进而增强了BMSCs修复损伤心脏的效果。该研究拟为研发Rspo1作为潜在药物以及为基因修饰提高BMSCs改善心脏损伤效应的可行性和有效性奠定基础。
成体干细胞不存在胚胎干细胞引发的伦理争议和诱导多能干细胞存在的基因不稳定的困扰，使其成为细胞再生医学领域的理想细胞系。成体干细胞中的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有容易获取，低免疫原性，易于外源基因导入等优点，成为再生医学中应用最广泛的种子细胞。临床前期研究表明，移植到梗死心肌部位的BMSCs能够促进血管再生改善心肌缺血微环境，缩小了梗死面积，不同程度地改善了心功能不全。但是，2006年到2016年的一期和二期临床Meta分析显示，移植BMSCs对心脏功能的改善有限或者没有效果，其中最主要的瓶颈问题是移植体内的BMCSs存活力低、保留下来的BMSCs改善心功能的有效性低。
因此，研发新的策略以显著提高干细胞修复心脏损伤的效果显得尤为重要。临床前期研究表明，基因修饰具有多模式性、能覆盖干细胞治疗的几个挑战性问题，基因与细胞治疗相结合成为提高干细胞治疗效率的有效途径。基因修饰可以通过提高干细胞的旁分泌功能促进血管再生、提高移植干细胞存活率和归巢，可以高效、靶向传递治疗性基因产物，进而增强干细胞修复损伤的效果。BMSCs具有易于获得；体外扩增10亿倍或更多倍数时干细胞的多向分化潜力仍然保持；外源基因较易于转入，并容易和BMSCs的基因组整合，稳定表达蛋白，而BMSCs的特性不受影响；具有较强的端粒酶活性、旁分泌功能等优势，使BMSCs成为基因治疗的良好载体。
脊椎顶板蛋白1(Roof plate-specific spondin 1，R-spondin 1，Rspo1)属于Rspo分泌蛋白家族成员之一，Rspo1作为Wnt/β-catenin信号通路的激活剂可放大经典/非经典Wnt/β-catenin信号通路。研究显示，基因Rspo1通过维持干细胞的干性特征参与组织正常形态的发生；Rspo1对胃肠道和口腔黏膜上皮干细胞通过促进其增殖、抑制其凋亡修复损伤的黏膜；小鼠肠缺血再灌注损伤后肠道内分泌细胞通过基因Rspo1表达上调，以旁分泌方式激活Wnt/β-catenin信号通道，促进肠道上皮干细胞增殖并分化为肠道上皮从而修复受损的肠道上皮；Rspo1蛋白促进成骨细胞分化成熟增加骨形成，缓减骨关节炎的损害；Rspo1蛋白促进糖尿病小鼠的胰岛β-细胞修复和再生。研究还显示，Rspo1作为血管生成因子可以促进血管生成，2011年Gore研究发现，基因Rspo1通过激活Wnt-Vegfc-Vegfr3信号通路使斑马鱼胚胎血管内皮细胞增生并以出芽方式促进血管发生(angiogenesis)。Rspo1促进皮肤血管生成。Rspo1存在于睾丸形态发生的所有阶段，在睾丸血管发生的主要组分睾丸体腔上皮表达，作为胚胎睾丸分泌的血管生成因子通过PDGF-b基因表达调控睾丸的血管发生。Rspo1通过Wnt-Vegfc-Vegfr3信号通路在肿瘤血管发生中也起重要作用。上述研究提示，基因Rspo1在成体干细胞的增殖、分化、干性维持和血管发生中起促进作用。然而，基因Rspo1对BMSCs的生存能力、分化潜能以及提高BMSCs改善心脏损伤的效应目前尚无报导。
课题组前期研究结果显示，大鼠心脏发育畸形和正常心脏组织经IlluminaHiSeqTM2000高通量测序，基因Rspo1表达明显下调；Rspo1蛋白在大鼠心肌梗死区表达下调。结果提示，基因Rspo1可能在心脏损伤中发挥作用，基此本课题的研究内容如下：
首先，我们以腺病毒为载体将Rspo1转染大鼠BMSCs使BMSCs高表达Rspo1，通过观察Rspo1对BMSCs凋亡、增殖和分化的作用，研究Rspo1对BMSCs生存能力和分化能力的影响。结果显示，与BMSCs组和阴性对照BMSCs-GFP组相比较，表达Rspo1的BMSCs的增殖增加、凋亡下降以及向心肌样细胞的分化能力增强，表明Rspo1可以增强BMSCs的生存能力和分化能力。
第二，在Rspo1细胞水平可以增强BMSCs的生存和分化能力基础上，在体水平研究心肌移植表达Rspo1的BMSCs对MI大鼠心肌损伤的修复效应。结果显示，与单纯移植BMSCs相比较，Rspo1能够提高移植BMSCs的移植存活率，Rspo1通过促进梗死区微血管再生、减小心肌梗死面积以及抑制心肌损伤部位细胞的凋亡，提高了BMSCs修复损伤心脏的心功能。
第三，基因修饰通过增强BMSCs旁分泌生物活性分子，在提高BMSCs修复受损心脏的效应中发挥重要作用。其中，基因通过增加干细胞分泌血管生成因子促进新生血管的形成，增加心肌梗死区的血流灌注，改善移植干细胞生存的缺氧微环境，在增强干细胞修复心脏损伤中作用关键。基此，我们采用同重同位素标记定量(IBT)质谱技术，对表达基因Rspo1的BMSCs进行蛋白质定量分析，筛选促血管生成因子中表达差异最大的因子，并分析该因子发挥促进血管再生作用的可能信号通路。结果发现，Rspo1增强BMSCs修复损伤心脏的作用可能与Rspo1增加BMSCs分泌血管成因子Dock4和CollagenⅣ-α3进而促进血管再生有关。Dock4可能通过Rap1信号通路在Rspo1促进血管再生过程中发挥关键作用；CollagenⅣ-α3作为血管基膜的组分，通过细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和受体整合素(Integrin)家族中的VLA蛋白相互作用信号通路在血管再生过程的血管基膜组装中发挥作用。
总之，本课题研究表明，基因Rspo1通过提高BMSC的移植存活率以及通过增加BMSCs旁分泌血管生成因子促进血管再生进而增强了BMSCs修复损伤心脏的效果。该研究拟为研发Rspo1作为潜在药物以及为基因修饰提高BMSCs改善心脏损伤效应的可行性和有效性奠定基础。