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两栖动物是一类在进化和适应上具有十分重要和特殊意义的脊椎动物，是脊椎动物从水生到陆栖的过渡类群，约3.5亿年前其水栖祖先登陆，并逐渐适应陆地生活演变成不同类群。两栖动物皮肤湿润、裸露更容易遭受外界病原微生物的侵袭，免疫适应无疑是两栖类起源和适应辐射过程中需要解决的关键问题之一。两栖类作为低等的陆栖脊椎动物，获得性免疫尚不完善，先天免疫系统在两栖类对外界刺激及病原微生物侵袭的防御反应中发挥重要作用。Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是参与机体先天性免疫的一类重要模式识别分子，是连接先天性免疫和获得性免疫的重要桥梁。大树蛙(Zhangixalus dennysi)隶属于两栖纲、无尾目、树蛙科、张树蛙属，因其独特的树栖生活方式，受到进化生物学家广泛关注。然而，迄今为止，大树蛙TLRs的种类、结构及进化尚不清楚。
本研究以大树蛙为研究对象，通过第三代测序技术获得了大树蛙脑转录组数据，对脑转录组序列进行了组装和功能注释，基于cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技术克隆测定了TLR2、TLR4及其信号通路下游关键基因MYD88的全长cDNA序列，通过序列比对、理化性质、结构预测等生物信息学分析揭示了大树蛙TLR2、TLR4和MYD88的氨基酸组成、结构域及蛋白质性质，基于最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和贝叶斯法(Bayesian Inference, BI)重建了脊椎动物代表物种TLR2、TLR4和MYD88的基因树。
主要结果如下：
(1)首次获得了大树蛙脑转录组数据，包含35244个大于500bp的unigene，19123个大于1000bp的unigene，共有18711个unigene通过SWISSPROT注释，13878个unigene进行了KOG功能注释，16810个unigene进行了GO功能注释，其中大部分基因参与了不同生物过程和信号传导。本研究是首次对非模式生物大树蛙转录组进行测序，所获得的序列将为大树蛙系统分类、生理生化以及适应性进化研究提供基础资料和数据。
(2)首次克隆得到了大树蛙TLRs家族关键成员TLR2全长、TLR4近于全长和MyD88全长的cDNA编码区序列。大树蛙TLR2开放阅读框长度为2362bp，编码786个氨基酸，蛋白质相对分子量为89.9kD，预测的理论等电点为5.83，包含胞外、跨膜和胞内3个结构域，含有1个信号肽、1个跨膜区、1个低复杂结构域、9个LRR基序和1个TIR结构域。大树蛙TLR4获得的开放阅读框缺失5’端部分序列，长度为2287bp，编码761个氨基酸，包含有6个LRR基序、1个低复杂结构域、1个LRRTYP基序、1个LRRCT基序、1个跨膜区以及1个TIR结构域。大树蛙MyD88完整开放阅读框长度为862bp,编码286个氨基酸，蛋白分子量为32.8kD，预测的理论等电点为5.83，含有1个DEATH结构域、1个TIR结构域。
(3)对脊椎动物TLR2、TLR4和MyD88基因系统发育分析表明，TLR2和TLR4在脊椎动物不同类群中变异较大，MyD88基因相对保守，TLR2、TLR4和MyD88可能在两栖类和脊椎动物不同类群中发生了适应性变异，推测TLR2、TLR4和MyD88在两栖类水生到陆生免疫适应过程中发挥重要作用。
本研究以大树蛙为研究对象，通过第三代测序技术获得了大树蛙脑转录组数据，对脑转录组序列进行了组装和功能注释，基于cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技术克隆测定了TLR2、TLR4及其信号通路下游关键基因MYD88的全长cDNA序列，通过序列比对、理化性质、结构预测等生物信息学分析揭示了大树蛙TLR2、TLR4和MYD88的氨基酸组成、结构域及蛋白质性质，基于最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和贝叶斯法(Bayesian Inference, BI)重建了脊椎动物代表物种TLR2、TLR4和MYD88的基因树。
主要结果如下：
(1)首次获得了大树蛙脑转录组数据，包含35244个大于500bp的unigene，19123个大于1000bp的unigene，共有18711个unigene通过SWISSPROT注释，13878个unigene进行了KOG功能注释，16810个unigene进行了GO功能注释，其中大部分基因参与了不同生物过程和信号传导。本研究是首次对非模式生物大树蛙转录组进行测序，所获得的序列将为大树蛙系统分类、生理生化以及适应性进化研究提供基础资料和数据。
(2)首次克隆得到了大树蛙TLRs家族关键成员TLR2全长、TLR4近于全长和MyD88全长的cDNA编码区序列。大树蛙TLR2开放阅读框长度为2362bp，编码786个氨基酸，蛋白质相对分子量为89.9kD，预测的理论等电点为5.83，包含胞外、跨膜和胞内3个结构域，含有1个信号肽、1个跨膜区、1个低复杂结构域、9个LRR基序和1个TIR结构域。大树蛙TLR4获得的开放阅读框缺失5’端部分序列，长度为2287bp，编码761个氨基酸，包含有6个LRR基序、1个低复杂结构域、1个LRRTYP基序、1个LRRCT基序、1个跨膜区以及1个TIR结构域。大树蛙MyD88完整开放阅读框长度为862bp,编码286个氨基酸，蛋白分子量为32.8kD，预测的理论等电点为5.83，含有1个DEATH结构域、1个TIR结构域。
(3)对脊椎动物TLR2、TLR4和MyD88基因系统发育分析表明，TLR2和TLR4在脊椎动物不同类群中变异较大，MyD88基因相对保守，TLR2、TLR4和MyD88可能在两栖类和脊椎动物不同类群中发生了适应性变异，推测TLR2、TLR4和MyD88在两栖类水生到陆生免疫适应过程中发挥重要作用。