论文部分内容阅读
研究背景:急性肾损伤的发生在住院患者中较为常见，并且预后不佳。近十年来，成人和儿童急性肾损伤的发病率均显著增加。患有复杂系统性疾病的儿童即使从急性肾损伤中存活下来，仍有很高的风险发展成慢性肾脏疾病。缺血缺氧性肾脏损伤是急性肾损伤的最主要原因，肾缺血再灌注损伤是缺血性急性肾损伤的主要原因之一。急性肾损伤的主要处理措施是去除病因，维持内环境稳定。到目前为止，对急性肾损伤尚无有效的药物治疗措施。拉西地平作为一种新型的第三代二氢吡啶类钙通道阻滞剂，已经有效地用于高血压的治疗，研究发现拉西地平可预防中毒性肾损害。然而其在急性肾损伤中的潜在作用尚不清楚。本课题以建立体外细胞模型模拟肾脏急性肾损伤为基础，探讨拉西地平对缺氧再复流致人肾小管上皮细胞凋亡的作用及作用机制。 方法:以特定剂量相同作用时间的抗霉素A（终浓度为0.0001μM至10μM）和拉西地平（终浓度为0.01μM至100μM），作用于人肾小管上皮细胞(HKC)，应用细胞计数实验检测拉西地平和抗霉素A作用后的人肾小管上皮细胞活性。根据实验结果，选定应用0.01μM的抗霉素A作用于人肾小管上皮细胞制备实验模型。0.01μM的抗霉素A作用于人肾小管上皮细胞2小时，拉西地平在抗霉素A作用前提前加入细胞中共同孵育24小时，应用流式细胞技术检测人肾小管上皮细胞在应用拉西地平前后的凋亡率。应用分光光度法检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活性。应用蛋白印记分析检测凋亡蛋白Bax，Bcl-2，细胞色素C的水平变化。 结果:抗霉素A对人肾小管上皮细胞细胞活力的影响:抗霉素A在体外实验中对人肾小管上皮细胞的影响随抗霉素A浓度升高而增加。0.01μM组和10μM组之间细胞活力存在明显的差异。根据此实验结果，在后续的实验当中，我们选择0.01μM浓度的抗霉素A作为实验浓度;拉西地平对人肾小管上皮细胞细胞活力的影响:抗霉素A在体外实验中对人肾小管上皮细胞的影响随拉西地平浓度升高而增加。从1μM组到100μM组，OD值逐渐下降。根据此实验结果，我们选择1μM和10μM浓度的拉西地平进行后续实验;抗霉素A诱导人肾小管上皮细胞凋亡:人肾小管上皮细胞应用抗霉素A(0.01μM，2h)后分别恢复至正常培养基0，15，30，60，120分钟。流式细胞仪检测人肾小管上皮细胞发生凋亡改变，其中15，30，60分钟组凋亡率升高。在ATP耗竭2小时，再恢复30分钟组，凋亡改变最明显。与此结果一致的是该组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3改变最为明显。据此实验结果，在后续实验中我们选择该时间组作为制造模型时间;拉西地平减轻抗霉素A诱导人肾小管上皮细胞所致的凋亡:拉西地平实验组较对照组早期细胞凋亡率明显降低。拉西地平实验组的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3活性较对照组明显降低;拉西地平对凋亡路径的影响:拉西地平明显地增加了Bcl-2的表达水平，并且明显降低了Bax及细胞色素C的表达水平。拉西地平通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3依赖性通路减轻由ATP耗竭再恢复所致的人肾小管上皮细胞凋亡。 结论:拉西地平可以减轻ATP耗竭再恢复导致的人肾小管上皮细胞凋亡;拉西地平通过调节细胞凋亡的线粒体途径减轻ATP耗竭再恢复导致的人肾小管上皮细胞凋亡;拉西地平对ATP耗竭再恢复导致细胞损伤的保护作用呈浓度相关性，随浓度增加而增强。