【摘 要】
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目的骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一群能不断自我更新、分裂增殖,且具多谱系分化潜能的多能干细胞。碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)和表皮生长因子(EGF)能有效促进BMSCs向神经
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目的骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一群能不断自我更新、分裂增殖,且具多谱系分化潜能的多能干细胞。碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)和表皮生长因子(EGF)能有效促进BMSCs向神经元样细胞分化,且对细胞几乎无毒副作用。单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)是神经细胞质膜的重要组成成分,对神经细胞分化和成熟过程必不可少,并可保护和修复受损神经细胞。本研究旨在探讨GM1联合生长因子(b FGF+EGF)能否更为高效地促进BMSCs分化为神经元样细胞,从而为细胞替代治疗神经系统变性疾病提供实验依据。方法采用密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞,行原代、传代培养,观察细胞形态变化和生长情况;取第3代BMSCs,用流式细胞术鉴定其表面标志物(CD29、CD105、CD34、CD45);同时鉴定其多分化潜能。将第3代BMSCs分四组向神经元样细胞诱导分化,A组:单用生长因子(b FGF+EGF);B组:单用GM1;C组:GM1联合生长因子(b FGF+EGF);D组:对照组。分别在正式诱导前、后行免疫细胞化学法检测各组细胞Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP的阳性表达率并用SPSS18.0进行数据统计分析。结果骨髓单个核细胞接种于培养瓶24h后可见多数细胞已贴壁,48h首次全量换液,可见较多骨髓单个核细胞散在分布。原代培养5-6天可见散在分布的短梭形、多角形或宽大扁平形细胞而形成的集落;8-11天,细胞生长速度明显加快,形态逐渐变成梭形;14-16天,细胞逐渐铺满培养瓶底,可达80%-90%融合,呈漩涡状分布;传代后的细胞,形态与原代相似,但其生长潜伏期明显缩短。流式细胞术鉴定第3代BMSCs表面标志物呈CD29(+)、CD105(+)、CD34(-)、CD45(-);同时其具分化为成骨细胞和成脂细胞潜能。BMSCs诱导分化为神经元样细胞之前,四组细胞Nestin、β-Tubulin、GFAP表达均呈阴性;正式诱导2-4天,A、B、C三组Nestin阳性细胞表达率均呈上升趋势,且C组高于A、B、D组;正式诱导6-8天,A、B、C三组Nestin阳性细胞表达率均有所降低,而β-TubulinⅢ、GFAP阳性细胞表达率则呈较明显上升趋势,且C组较A、B组升高明显。综合实验数据,C组的Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP阳性细胞表达率均高于A、B、D组。结论1.采用密度梯度离心法结合细胞贴壁培养法来分离、培养BMSCs,可获得较高纯度的BMSCs,且细胞活性较高,适用于进一步实验研究。2.GM1联合生长因子(b FGF+EGF)相比单独的生长因子(b FGF+EGF)或GM1,可更为高效地促进BMSCs诱导分化为神经元样细胞。
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