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肌醇磷酸合酶(Myo-inositol phosphate synthase,MIPS,EC5.5.1.4)在植物中催化D-葡萄糖6磷酸为1-L型肌醇-1-磷酸,是植酸和各种肌醇化合物生物合成途径的第一步和限速步骤。植酸广泛存在于植物种子中,是植物体内多种组织磷元素的主要贮存形式,肌醇及其化合物广泛参与到了植物对各种环境因子的响应,特别是磷酸化的肌醇及肌醇衍生物在细胞信号传导、钙离子迁移、激素刺激作用、胞外分泌、细胞骨架调节及特定蛋白与细胞膜的锚定等生物现象中发挥着重要的作用。 水稻基因组中有两个肌醇磷酸合酶同源基因(OsMIPS1,OsMIPS2),其在核酸和蛋白水平上均具有较高的同源性。本研究对OsMIPS基因、启动子、蛋白结构进行了生物信息学分析;在转录水平上研究了OsMIPS1,2在水稻中的表达模式,及其对低温、干旱、盐、高温等不同逆境胁迫的响应;构建了针对OsMIPS1、OsMIPS2启动子区的基因沉默和OsMIPS1的过表达载体,通过对获得的转化苗植株的分析,探讨了OsMIPS在水稻生长发育和对逆境胁迫抗性中的功能。本论文主要结果如下: 1.分别克隆了20多种不同野生稻和栽培稻的MIPS1、MIPS2启动子序列并进行了生物信息学分析。结果显示:不管是MIPS1还是MIPS2,总体上不同品种野生稻或不同品种栽培稻群体在进化上各自具有较近的亲缘关系:在野生稻或栽培稻中MIPS1、MIPS2启动子序列中均存在大量与逆境胁迫相关的顺式作用元件。其中存在于OsMIPS1、OsMIPS2启动子中与低温、干旱、高温相关的元件LTR、HSE、MBS也广泛存在于其他不同品种野生稻和栽培稻MIPS1、MIPS2启动子序列中。但是,也发现栽培稻中普遍存在的缺失及个别顺式作用元件在野生稻中并不存在。上述结果提示水稻中MIPS可能与多种逆境胁迫有关,且栽培稻和野生稻中MIPS对逆境胁迫的响应可能存在一些差异。 2.通过半定量RT-PCR研究了水稻在叶、穗不同发育时期及不同组织器官中的表达模式。发现除OsMIPS1在种子中没有表达外,OsMIPS1、OsMIPS2在水稻中的表达模式很相似。在叶片和穗发育过程中,表达量均逐渐升高,在茎和根中表达量相对较低。除了在小孢子母细胞形成期OsMIPS2表达量比OsMIPS1低外,其它整体上OsMIPS2表达水平较OsMIPS1高。 3.通过实时荧光定量PCR研究了水稻OsMIPS1、OsMIPS2对不同逆境胁迫的响应。结果显示:在低温胁迫下OsMIPS1的表达量升高,OsMIPS2表达量降低;而在高温胁迫下OsMIPS1的表达量降低,OsMIPS2的表达量升高;在干旱和盐胁迫下,OsMIPS1和OsMIPS2的表达均有不同程度的降低。研究结果说明OsMIPS1、OsMIPS2能够响应不同逆境胁迫,OsMIPS1参与水稻低温胁迫抗性的可能性较大。 4.分别构建了靶向OsMIPS1、OsMIPS2启动子区的基因沉默和Ubi启动子驱动OsMIPS1的过表达载体转化水稻中花11,对获得的T0代转基因植株进行表型分析,观察到OsMIPS1沉默部分转化植株株高变矮,分蘖减少,同时结实率降低,种子植酸和叶片肌醇含量降低;OsMIPS2的沉默使水稻花粉可染率有所下降,但表型上与中花差异不大。OsMIPS1过表达植株中,OsMIPS1表达量升高相对较低(5倍)时对水稻生长发育无明显影响,OsMIPS1高水平表达(表达升高50倍)时,显著的影响了水稻穗发育,OsMIPS1高表达植株肌醇含量升高。 5.对获得的转基因植株T1代幼苗进行了高温、低温处理,表型观察和相对电导率的测定结果显示:OsMIPS1过表达植株能增加对低温胁迫的抵抗但不能增加对高温胁迫的抵抗,OsMIPS1沉默的植株对低温和高温胁迫的抵抗都有不同程度的降低,OsMIPS2沉默的植株对低温胁迫抗性未降低但对高温胁迫抗性有所降低。 上述研究结果表明:OsMIPS是影响水稻生长发育和逆境胁迫抗性的多效性基因,OsMIPS1和OsMIPS2分别对低温、高温胁迫有正响应,两个同源基因对逆境胁迫的响应各不相同,OsMIPS1的过表达能增强水稻对低温胁迫的抵抗。