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第一部分、红豆杉中新紫杉烷类二萜类化合物体外抗人子宫内膜癌活性筛选子宫内膜癌是女性生殖道常见的恶性肿瘤，尽管子宫内膜癌的早期诊断及治疗方法取得了很大进展，但其年发病率及死亡率仍在不断升高。药物治疗已成为复发性内膜癌的主要治疗方式。植物源性药物在多种疾病尤其是癌症的治疗中发挥着主导作用，从太平洋红豆杉（Taxus brevifolia）树皮中分离得到的紫杉醇(Taxol)是临床上最为重要的抗癌制剂。由于紫杉醇是从太平洋红豆杉的树皮中分离得到的，而太平洋红豆杉生长速度慢，树皮中紫杉醇含量低，一旦剥离树皮树木也难以生存，大大限制了紫杉醇的开发利用。因此亟待寻找具有较低毒副作用、较高抗肿瘤选择性及对多种肿瘤细胞尤其是对有抗药性的人体肿瘤细胞有较高生物活性的紫杉烷类化合物。
目的:为寻找活性强、毒副作用小的化合物，本研究对红豆杉可再生针叶中提取纯化得到的48种非紫杉醇二萜类化合物为对象，对人子宫内膜癌细胞增殖抑制活性进行了筛选，这对于扩大植物药源，寻找和开发新的抗癌先导化合物或药物都具有重要意义。
方法:应用MTT比色法进行活性筛选。细胞接种于96孔板，每孔含1×104个细胞，分别加入溶剂对照（终浓度0.1％ DMSO）、阳性对照紫杉醇和终浓度为100μmol/L各种实验用化合物，每组设3复孔，置于饱和湿度、37℃和5％ CO2培养箱中培养48 h。于培养结束前4h，各培养孔加入5 mg/mL MTT。实验终止测定各孔吸光度值(OD值)，测定波长入=570 nm，参考波长入=630 nm，并计算细胞存活率。细胞存活率(％)=（给药组OD值/对照组OD值）×100;计算实验用化合物的半数抑制浓度(IC50)值。
结果:48种紫杉烷类化合物抑制人子宫内膜癌细胞HEC-1的增殖活性的筛选结果为:18种紫杉烷类化合物对HEC-1细胞增殖的抑制活性极显著高于对照组(P＜0.01)。当用100μmol/L10-deacetyl-13-oxobaccatinⅢ(1),13-oxobaccatinⅢ(2), baccatinⅢ(3),9-dihydro-13-acetyl-baccatinⅢ(4)处理HEC-1细胞48 h后肿瘤细胞的存活率分别为48.94％、40.17％、22.51％和28.34％;100μmol/L7-epi-10-deacetyltaxol(5),7,13-dideacetyl-9,10-didebenzoyl-taxchinin C(6),10β-hydroxy-2α,9α,13α-triacetoxy-5α-cinnamatetaxa-4(20),11-diene(10)和7β,9α-dideacetyl-5-decinnamoyl-taxinine J(11)处理HEC-1细胞48 h后肿瘤细胞的存活率分别为6.00％、72.85％、10.52％和19.97％;当用100μmol/L11-diene(12)、10-deacetyltaxinine(17)、9,10-deacetyltaxinine(19)和taxagifin(25)处理HEC-1细胞时，细胞存活率分别为12.91％、33.80％、8.78％和25.33％;当用100μmol/L taxezopidine J(27)、2α,10β-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(29)、2,9-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(30)和taxachitriene A(32)处理HEC-1时，细胞存活率分别为:19.85％、7.64％、4.61％和67.00％;当用100μmol/L5α-cinnamoyloxytaxin B(37)和5α，10β,13α-triacetoxytax-11-ene-2α，7β，9α，20-tetraol(44)作用HEC-1细胞时，存活率分别为42.15％和49.37％。其中，化合物(5)、(10)、(19)、(29)和(30)对HEC-1细胞增殖的抑制活性高于紫杉醇，五种化合物对HEC-1细胞的IC50值分别为0.15μmol/L、3.75μmol/L、4.91μmol/L、1.08μmol/L和3.96μmol/L，化合物(5)和(29)的IC50值低于紫杉醇。
结论:从红豆杉科植物的针叶中提取的化合物(5)、(10)、(19)、(29)和(30)五种非紫杉醇二萜类化合物对人子宫内膜癌细胞具有较强的增殖抑制活性。
第二部分、新紫杉烷类化合物构-效关系研究紫杉烷类化合物是从植物中得到的一大类天然产物，在结构分类上属于二萜类，故又称之为紫杉烷二萜。紫杉醇(Taxol)是从红豆杉属（Taxus）植物中分离得到的紫杉烷二萜成分，其显著的抗肿瘤活性和独特的作用机理令世人嘱目。尽管紫杉醇的临床应用广泛且取得了巨大成功，但仍存在药物溶解性低、毒副作用大、耐药现象等诸多问题，因此对其构效关系及结构改造的探讨已成为当今研究的热点，以期找到天然结构更简单、活性更强的类似物或替代分子。
目的:为系统分析紫杉烷类化合物抗肿瘤活性与化学结构之间的关系，将从红豆杉分离提取的48种紫杉烷类化合物依据其母核及侧链结构进行分组，研究了其对子宫内膜癌细胞及其他妇科肿瘤细胞增殖抑制活性的影响，以期为紫杉烷类化合物的开发和利用提供合成实验的依据。
方法:将48种紫杉烷类化合物按结构分为四组:1、具有4，5，20-oxetanring结构的非紫杉醇二萜类化合物（化合物1-7）;2、具有C-4，20 doublebond结构的非紫杉醇二萜类化合物（化合物8-22）;3、具有12，16-Epoxytaxanes结构（化合物23-26）、13，16-Epoxytaxanes结构（化合物27）、C-4，20 double bond oxygenated结构（化合物43-45）、C-4，20 doublebond with C-12，17-epoxide结构（化合物46）及C-11，12 seco-taxane with C4，20 double bond结构（化合物47）的非紫杉醇二萜类化合物;4、具有3，11-cyclotaxanes结构（化合物28-30）和Bicyclic Taxoids结构(化合物31-33)及2(3→20)abeotaxanes结构（化合物34-42）的非紫杉醇二萜类化合物，应用MTT比色法（与第一部分相同）进行活性筛选。
结果:具有4，5，20-oxetan ring结构的紫杉烷类化合物中1位碳原子连接较大取代基的化合物抗肿瘤活性较低，抗肿瘤活性随羟基取代基数目的增加而增加;具有6/8/6母核结构的紫杉烷类化合物的抗肿瘤活性与C-5位连有的肉桂酰基侧链有一定的相关性;具有3，11-cyclotaxanes母核结构的紫杉烷类化合物抗肿瘤活性较强;具有2(3→20) abeotaxanes和bicyclictaxoids母核结构的紫杉烷类化合物均显示较弱的抗肿瘤活性;化合物(29)具有与紫杉醇极为相似的最小能量化三维立体构象;紫杉烷类化合物(5)，(10)，(19)，(29)和(30)具有广谱抗肿瘤活性。
结论:抗人子宫内膜癌细胞活性不仅与紫杉烷类化合物的骨架结构密切相关，而且该类化合物抗人子宫内膜癌细胞活性可能还与C-5位具有的肉桂酰基侧链以及化合物含有的羟基侧链的数目有一定的相关性;红豆杉中纯化的非紫杉烷化合物7-epi-10-deacetyltaxol(5)、10β-hydroxy-2α，9α，13α-triacetoxy-5α-cinnama-tetaxa-4(20),11-diene(10)、9,10-deacetyl-taxinine(19)、2α,10β-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(29)和2α,9α-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(30)不仅对人子宫内膜癌细胞具有较强的抑制活性，而且对其他实验妇科肿瘤细胞同样具有较强的抑制活性。
第三部分、9-去乙酰-3，11-环化紫杉宁抗子宫内膜癌作用机制研究癌症治疗的主要目的是选择性摧毁肿瘤细胞。具细胞毒性的抗癌药物可造成不可修复的DNA损伤，引发细胞凋亡，最终造成肿瘤细胞死亡。常用化疗药物抗肿瘤治疗的机制与诱导细胞凋亡相关。天然植物产物是抗癌活性成分的重要来源，这些成分多通过诱导细胞凋亡而发挥作用。
目的:前期研究发现从红豆杉针叶中分离提取的化合物(29)即9-去乙酰-3，11-环化紫杉宁对子宫内膜癌细胞增殖具有明显的抑制活性，本实验进一步分析了化合物(29)对子宫内膜癌细胞凋亡及凋亡信号通路中重要蛋白表达量的影响，以期明确其抗癌机制。
方法:1.TUNEL法观察细胞凋亡情况。化合物(29)终浓度为10μmol/L处理HEC-1细胞，24 h后弃去培养液，用TUNEL检测试剂盒检测，荧光显微镜下，观察，拍照。2.流式细胞术(flow cytometry，FCM)观察化合物(29)作用HEC-1细胞后的凋亡情况。细胞传代进入对数生长期，随机分组，实验组加入10μmol/L的化合物(29)，空白对照组加入DMSO，于培养48 h后收集细胞，用4℃预冷的PBS洗细胞两次，用250μL结合缓冲液重新悬浮细胞，调整其浓度为1×106/mL，取100μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5μL Annexin V/FITC和10μL的PI溶液(20μg/mL)，混匀后于室温避光孵育15 min，在反应管中加400μL稀释好的结合缓冲液，及时上流式细胞仪分析。每次实验重复3次。3.Western Blotting技术观察化合物(29)作用子宫内膜癌细胞后4种蛋白因子p53、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达变化情况。用直径100 mm的培养皿培养HEC-1细胞，1×106个，三枚加入化合物(29)，终浓度为2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L，一枚加入顺铂，终浓度为20μmol/L，一枚为对照组。化合物作用人子宫内膜癌细胞48 h后，收集全细胞。裂解细胞后，聚丙烯凝胶电泳，牛奶封闭，转膜，依次与一抗和二抗孵育，化学发光，显影。4.利用MTT法检测了半胱天冬酶抑制剂对化合物(29)抑制人子宫内膜癌细胞增殖的翻转作用。使用0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L的化合物(29)处理HEC-1细胞，加入20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂与化合物(29)共同孵育48h后，MTT法测定OD值。5.利用MTT法检测了半胱天冬酶抑制剂对化合物(29)抑制其他妇科肿瘤细胞增殖的翻转作用。使用5μmol/L的化合物(29)分别处理人宫颈癌细胞HeLa、人卵巢透明囊腺癌细胞(SHIN3和HOC-21)及人透明癌细胞HAC-2，加入20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂与化合物(29)共同孵育48 h后，MTT法测定OD值。6.Western Blotting技术观察化合物(29)作用子宫内膜癌细胞后HSP90α的表达变化情况，具体方法同3.。
结果:
1.TUNEL染色显示，经化合物(29)作用24 h后的HEC-1细胞出现凋亡信号。
2.流式细胞仪检测结果显示，10μmol/L的化合物(29)处理HEC-1细胞24 h后细胞早期凋亡率为31.7％，而对照组仅为4.7％。
3.化合物(29)可显著诱导HEC-1细胞内的p53、Bax和caspase-3蛋白表达上调，p53及Bax的表达量随药物浓度增加而增加，在处理24 h时p53表达量最高，化合物(29)各剂量组的Bax/Bcl-2的比值均显著高于空白对照组(P＜0.05)，5μmol/L及10μmol/L处理组出现caspase-3活化片段。
4.使用0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L化合物(29)处理HEC-1细胞，其细胞生存率分别为67.13％、35.41％和1.87％，使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂与化合物(29)共同孵育HEC-1细胞后，其细胞生存率分别上升为83.11％、40.15％和6.53％，且20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂可显著翻转1μmol/L和10μmol/L化合物(29)对HEC-1细胞增殖的抑制活性（P＜0.05）。
5.20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂可显著翻转5μmol/L化合物(29)对HOC-21及HAC-2细胞增殖的抑制活性（P＜0.05）。6.化合物(29)处理HEC-1细胞后胞内HSP90α蛋白表达量降低，且10μmol/L处理组HSP90α的表达水平极显著低于对照组(P＜0.01)。
结论:
1.9-去乙酰-3，11-环化紫杉宁(29)通过诱导人子宫内膜癌HEC-1细胞凋亡而发挥抗肿瘤活性。
2.9-去乙酰-3，11-环化紫杉宁(29)对人子宫内膜癌的抗瘤活性机制与紫杉醇不同。
3.9-去乙酰-3，11-环化紫杉宁(29)通过p53通路发挥抗人子宫内膜癌活性，使p53表达量增高，从而使Bax表达量增高，Bcl-2表达受抑制，并进一步引起Caspase-3表达水平的增高，最终导致细胞凋亡。各蛋白因子的变化均具有浓度依赖性，p53的表达具有时间依赖性。