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日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的急性和慢性疾病，它引起肝纤维化主要致病的机理是，虫卵沉积导致肝脏虫卵肉芽肿以及继发性的肝纤维化形成。由于宿主对虫卵抗原持续产生免疫应答反应，使静止期的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)被异常激活，HSCs开始增殖，转变成为肌成纤维细胞，并表达α-平滑肌动蛋白以及分泌细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)，过量的ECM无法被降解，沉积在肝脏内，导致了肝纤维化的发生。近年来，不具备编码蛋白功能的lncRNA逐渐被人们认识，在众多肿瘤中表达异常，参与了细胞增殖、活化以及凋亡等多种生物学进程的调控。最近一些肝纤维化的研究发现，IncRNA可以通过调节HSCs的激活，来影响肝纤维化的发生、发展。目前，人们对lncRNA-p21、GAS5、MALATl、PVTl、IncRNA-H19在肝纤维化中的调控作用，研究的比较多。但这些lncRNA在日本血吸虫感染宿主，致肝纤维化过程中的作用机制尚未阐明。
课题组前期的研究发现，ICOS信号的下调，可以一定程度缓解肝纤维化和减轻HSCs的活化。在本课题的研究中，应用了ICOSL-KO小鼠及其野生型对照C57BL/6J小鼠，建立日本血吸虫病动物模型，探索ICOSL/ICOS信号在肝纤维化进程中对IncRNA的调控作用以及lncRNA对HSCs活化的影响，寻找抑制HSCs活化和治疗肝纤维化疾病的新途径。
本课题研究分为四个部分:
第一部分 日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离鉴定及培养
目的:提取纯度较高的小鼠原代HSCs，在体外培养7天，用来模拟HSCs在小鼠体内活化的状态，为后续实验奠定基础。
方法:(1)挑取5♂+7♀早条日本血吸虫尾蚴分别感染ICOS-KO小鼠，和野生型对照C57/BL6J小鼠，来建立日本血吸虫性肝纤维化模型。使用原位肝脏酶灌注的方法和通过密度梯度离心来获取，未感染、感染后4周、7周、9周、12周五个不同病期小鼠体内的原代HSCs，其中7周是感染急性病变期，12周是感染晚期。通过台盼蓝染色法鉴定原代HSCs的存活率。(2)活细胞工作站观察拍摄，在波长为328nm的紫外激发光下，HSCs自发的蓝绿色荧光并计数，鉴定细胞的纯度。(3)对HSCs进行GFAP免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察计数，鉴定细胞的纯度。
结果:(1)新鲜提取的小鼠原代细胞在培养的过程中，生长状态良好，活化变形明显。每只小鼠所获取到的细胞数量平均为(1.95±0.2)X106个/鼠，存活率能达到90％以上。(2)在活细胞工作站下，能够观察到新鲜分离的细胞培养过夜后，在328nm的紫外激发光下自发的蓝绿色荧光。(3)将HSCs培养3天后，进行GFAP免疫荧光染色，在荧光显微镜下，观察到胞浆中的红色荧光，通过计数得出细胞的纯度为90％以上。
结论:日本血吸虫感染小鼠建立的实验动物模型，所获取原代HSCs的存活率及纯度都在90％以上，符合了后续实验的要求。
第二部分 日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中肝组织免疫病理及HSCs相关IncRNA的动态表达
目的:检测在日本血吸虫尾蚴感染C57BL/6J小鼠慢性致病的过程中肝脏免疫病理及相关lncRNA的动态表达。
方法:(1)对肝脏组织切片进行HE染色，在显微镜下观察比较，不同感染病期小鼠的肝脏虫卵肉芽肿面积。
(2)分离未感染、感染后4周、7周、9周、12周的原代HSCs，在培养7d后，TRIzol Reagent抽提总RNA，应用实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR，Real-time PCR)法检测C57BL/6J小鼠原代HSCs中IncRNA-P21、lncRNA-H19、lncRNA-GAS5、IncRNA-MALAT1、IncRNA-PVT1的表达水平，分析比较各个基因在血吸虫病过程中的动态表达。
结果:(1)HE染色的结果:在未经日本血吸虫感染的小鼠肝脏组织切片中，观察到肝小叶结构完好，干细胞的形态良好，未出现损伤;而感染后的小鼠肝脏组织切片，肝小叶的正常结构被破坏，炎性细胞浸润在虫卵周围形成肉芽肿，并且伴随着纤维化的发生，随着感染周期的增加，肉芽肿的面积在感染7周(12.1±0.92)×104um2时最大，在9周、12周面积缩小，而胶原的沉积逐渐增加。
(2)日本血吸虫在感染C57BL/6J小鼠后，随着肝脏纤维化的发生、发展，lncRNA-PVT1、lncRNA-GAS5在HSCs中表达，自感染4周后lncRNA的表达开始上升，感染7周(PVT1，5.184±0.7346，gene/GAPDH，P＜0.01;GAS5，5.849±0.2907.gene/GAPDH，P＜0.0001)后表达达到了峰值，而在感染后9周、12周表达持续下降。lncRNA-H19的表达自感染后4周显著升高，但在感染后7周、9周、12周表达逐渐下降。IncRNA-P21的表达在4周开始显著下调，到7周、9周后有所回调，12周表达继续下调低于未感染组。lncRNA-MALAT1的表达从感染4周后开始上升，到7周(6.666±0.08177，gene/GAPDH，P＜0.0001)达到峰值，9周略微下降，仍保持在较高水平，12周后显著下调。
结论:在日本血吸虫的致病过程中，HSCs是持续呈活化状态，lncRNA-P21、lncRNA-H19在HSCs的表达较低，lncRNA-P21的表达随着肝纤维化程度的加重，表达均呈现下调的趋势;lncRNA-H19的分子表达在感染后7周，随着纤维化程度加重而逐渐下调。lncRNA-PVT1、lncRNA-GAS5、lncRNA-MALAT1的表达水平比较高，随着纤维化程度的加重而上调，研究结果提示上述lncRNA可能作为潜在的靶点调控肝纤维化的进程。
第三部分 共刺激信号ICOSL/ICOS对日本血吸虫感染小鼠的免疫病理形成及HSCs相关lncRNA动态表达的影响
目的:ICOS-KO小鼠建立日本血吸虫模型，探讨下调共刺激信号对肝脏病理变化及对相关lncRNA表达的影响。
方法;(1)采用HE染色的检测方法，处理ICOSL-KO小鼠和野生型C57BL/6J小鼠，五个感染周期的肝脏标本。
(2)收集五个感染周期的原代HSCs，在体外培养7d后，通过TRIzol Reagent抽提细胞总RNA，再逆转录成cDNA，实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR，Real-time PCR)分别检测ICOS.KO小鼠和C57BL/6J小鼠的原代HSCs中IncRNA-P21、lncRNA.H19、IncRNA-GAS5、lncRNA-MALAT1、IncRNA-PVTl的表达水平，分析比较它们的表达变化。
结果:ICOS-KO小鼠原代HSCs中，检测到IncRNA-P21、lncRNA-GAS5的表达高于同时期野生型C57BL/6J小鼠的表达(1ncRNA-P21，9w,2.071±0.1717vs0.9556±0.07206，P＜0.0001，gene/GAPDH)(1ncRNA-GAS5，7w，14.08±1.626vs5.849±0.2907，P＜0.0001，gene/GAPDH)。而IncRNA-PVTl(7w，3.721±0.2404vs5.184±0.7346，P＜0.05，gene/GAPDH)、lncRNA-H19(9w,1.71±0.4134vs6.235±0.1149，P＜0.0001，gene/GAPDH)、IncRNA-MALATl(9w,1.71±0.4134vs6.235±0.1149，P＜0.0001，gene/GAPDH)的表达水平低于同时期C57BL/6J小鼠的表达。
结论:在日本血吸虫致纤维化疾病中，相比野生型对照小鼠，ICOS-KO小鼠的肝纤维化显著减轻，表明ICOSL/ICOS信号的下调减轻了HSCs的活化，IncRNA的表达也受到了影响，其中具有抑制纤维化作用的IncRNA-P21、lncRNA-GAS5表达上调，而促纤维化作用的IncRNA-PVT1、IncRNA-H19、lncRNA-MALATl表达则受到抑制。研究结果提示在日本血吸虫致肝纤维化的病程中，ICOS信号对的lncRNA的表达具有调控作用并可影响肝纤维化的发生、发展。
第四部分 体外干扰5种lncRNA的表达对HSCs活化的影响
目的:观察小鼠肝星状细胞系JS-1转染siRNA对IncRNA介导HSCs活化的影响。
方法:肝星状细胞系JS-1传代培养稳定之后，转染siRNA，培养48h后，通过实时荧光定量PCR检测HSCs中α-SAM和Ⅰ型胶原蛋白的表达。
结果:干扰了lncRNA-P21、lncRNA-GAS5后可增加HSCs中α-SAM和Ⅰ型胶原蛋白的表达，而干扰lncRNA-PVT1、IncRNA-H19、lncRNA-MALATl后则可减少HSCs中α-SAM和Ⅰ型胶原蛋白的表达。
结论:实验结果表明，在日本血吸虫感染小鼠致纤维化的疾病中，lncRNA-P21、lncRNA-GAS5可抑制HSCs的活化，而lncRNA-PVTl、lncRNA-H19、lncRNA-MALATl则促进了HSCs的活化。LncRNA有望作为调节HSCs的活化控制肝纤维化的潜在靶点。
课题组前期的研究发现，ICOS信号的下调，可以一定程度缓解肝纤维化和减轻HSCs的活化。在本课题的研究中，应用了ICOSL-KO小鼠及其野生型对照C57BL/6J小鼠，建立日本血吸虫病动物模型，探索ICOSL/ICOS信号在肝纤维化进程中对IncRNA的调控作用以及lncRNA对HSCs活化的影响，寻找抑制HSCs活化和治疗肝纤维化疾病的新途径。
本课题研究分为四个部分:
第一部分 日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离鉴定及培养
目的:提取纯度较高的小鼠原代HSCs，在体外培养7天，用来模拟HSCs在小鼠体内活化的状态，为后续实验奠定基础。
方法:(1)挑取5♂+7♀早条日本血吸虫尾蚴分别感染ICOS-KO小鼠，和野生型对照C57/BL6J小鼠，来建立日本血吸虫性肝纤维化模型。使用原位肝脏酶灌注的方法和通过密度梯度离心来获取，未感染、感染后4周、7周、9周、12周五个不同病期小鼠体内的原代HSCs，其中7周是感染急性病变期，12周是感染晚期。通过台盼蓝染色法鉴定原代HSCs的存活率。(2)活细胞工作站观察拍摄，在波长为328nm的紫外激发光下，HSCs自发的蓝绿色荧光并计数，鉴定细胞的纯度。(3)对HSCs进行GFAP免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察计数，鉴定细胞的纯度。
结果:(1)新鲜提取的小鼠原代细胞在培养的过程中，生长状态良好，活化变形明显。每只小鼠所获取到的细胞数量平均为(1.95±0.2)X106个/鼠，存活率能达到90％以上。(2)在活细胞工作站下，能够观察到新鲜分离的细胞培养过夜后，在328nm的紫外激发光下自发的蓝绿色荧光。(3)将HSCs培养3天后，进行GFAP免疫荧光染色，在荧光显微镜下，观察到胞浆中的红色荧光，通过计数得出细胞的纯度为90％以上。
结论:日本血吸虫感染小鼠建立的实验动物模型，所获取原代HSCs的存活率及纯度都在90％以上，符合了后续实验的要求。
第二部分 日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中肝组织免疫病理及HSCs相关IncRNA的动态表达
目的:检测在日本血吸虫尾蚴感染C57BL/6J小鼠慢性致病的过程中肝脏免疫病理及相关lncRNA的动态表达。
方法:(1)对肝脏组织切片进行HE染色，在显微镜下观察比较，不同感染病期小鼠的肝脏虫卵肉芽肿面积。
(2)分离未感染、感染后4周、7周、9周、12周的原代HSCs，在培养7d后，TRIzol Reagent抽提总RNA，应用实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR，Real-time PCR)法检测C57BL/6J小鼠原代HSCs中IncRNA-P21、lncRNA-H19、lncRNA-GAS5、IncRNA-MALAT1、IncRNA-PVT1的表达水平，分析比较各个基因在血吸虫病过程中的动态表达。
结果:(1)HE染色的结果:在未经日本血吸虫感染的小鼠肝脏组织切片中，观察到肝小叶结构完好，干细胞的形态良好，未出现损伤;而感染后的小鼠肝脏组织切片，肝小叶的正常结构被破坏，炎性细胞浸润在虫卵周围形成肉芽肿，并且伴随着纤维化的发生，随着感染周期的增加，肉芽肿的面积在感染7周(12.1±0.92)×104um2时最大，在9周、12周面积缩小，而胶原的沉积逐渐增加。
(2)日本血吸虫在感染C57BL/6J小鼠后，随着肝脏纤维化的发生、发展，lncRNA-PVT1、lncRNA-GAS5在HSCs中表达，自感染4周后lncRNA的表达开始上升，感染7周(PVT1，5.184±0.7346，gene/GAPDH，P＜0.01;GAS5，5.849±0.2907.gene/GAPDH，P＜0.0001)后表达达到了峰值，而在感染后9周、12周表达持续下降。lncRNA-H19的表达自感染后4周显著升高，但在感染后7周、9周、12周表达逐渐下降。IncRNA-P21的表达在4周开始显著下调，到7周、9周后有所回调，12周表达继续下调低于未感染组。lncRNA-MALAT1的表达从感染4周后开始上升，到7周(6.666±0.08177，gene/GAPDH，P＜0.0001)达到峰值，9周略微下降，仍保持在较高水平，12周后显著下调。
结论:在日本血吸虫的致病过程中，HSCs是持续呈活化状态，lncRNA-P21、lncRNA-H19在HSCs的表达较低，lncRNA-P21的表达随着肝纤维化程度的加重，表达均呈现下调的趋势;lncRNA-H19的分子表达在感染后7周，随着纤维化程度加重而逐渐下调。lncRNA-PVT1、lncRNA-GAS5、lncRNA-MALAT1的表达水平比较高，随着纤维化程度的加重而上调，研究结果提示上述lncRNA可能作为潜在的靶点调控肝纤维化的进程。
第三部分 共刺激信号ICOSL/ICOS对日本血吸虫感染小鼠的免疫病理形成及HSCs相关lncRNA动态表达的影响
目的:ICOS-KO小鼠建立日本血吸虫模型，探讨下调共刺激信号对肝脏病理变化及对相关lncRNA表达的影响。
方法;(1)采用HE染色的检测方法，处理ICOSL-KO小鼠和野生型C57BL/6J小鼠，五个感染周期的肝脏标本。
(2)收集五个感染周期的原代HSCs，在体外培养7d后，通过TRIzol Reagent抽提细胞总RNA，再逆转录成cDNA，实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR，Real-time PCR)分别检测ICOS.KO小鼠和C57BL/6J小鼠的原代HSCs中IncRNA-P21、lncRNA.H19、IncRNA-GAS5、lncRNA-MALAT1、IncRNA-PVTl的表达水平，分析比较它们的表达变化。
结果:ICOS-KO小鼠原代HSCs中，检测到IncRNA-P21、lncRNA-GAS5的表达高于同时期野生型C57BL/6J小鼠的表达(1ncRNA-P21，9w,2.071±0.1717vs0.9556±0.07206，P＜0.0001，gene/GAPDH)(1ncRNA-GAS5，7w，14.08±1.626vs5.849±0.2907，P＜0.0001，gene/GAPDH)。而IncRNA-PVTl(7w，3.721±0.2404vs5.184±0.7346，P＜0.05，gene/GAPDH)、lncRNA-H19(9w,1.71±0.4134vs6.235±0.1149，P＜0.0001，gene/GAPDH)、IncRNA-MALATl(9w,1.71±0.4134vs6.235±0.1149，P＜0.0001，gene/GAPDH)的表达水平低于同时期C57BL/6J小鼠的表达。
结论:在日本血吸虫致纤维化疾病中，相比野生型对照小鼠，ICOS-KO小鼠的肝纤维化显著减轻，表明ICOSL/ICOS信号的下调减轻了HSCs的活化，IncRNA的表达也受到了影响，其中具有抑制纤维化作用的IncRNA-P21、lncRNA-GAS5表达上调，而促纤维化作用的IncRNA-PVT1、IncRNA-H19、lncRNA-MALATl表达则受到抑制。研究结果提示在日本血吸虫致肝纤维化的病程中，ICOS信号对的lncRNA的表达具有调控作用并可影响肝纤维化的发生、发展。
第四部分 体外干扰5种lncRNA的表达对HSCs活化的影响
目的:观察小鼠肝星状细胞系JS-1转染siRNA对IncRNA介导HSCs活化的影响。
方法:肝星状细胞系JS-1传代培养稳定之后，转染siRNA，培养48h后，通过实时荧光定量PCR检测HSCs中α-SAM和Ⅰ型胶原蛋白的表达。
结果:干扰了lncRNA-P21、lncRNA-GAS5后可增加HSCs中α-SAM和Ⅰ型胶原蛋白的表达，而干扰lncRNA-PVT1、IncRNA-H19、lncRNA-MALATl后则可减少HSCs中α-SAM和Ⅰ型胶原蛋白的表达。
结论:实验结果表明，在日本血吸虫感染小鼠致纤维化的疾病中，lncRNA-P21、lncRNA-GAS5可抑制HSCs的活化，而lncRNA-PVTl、lncRNA-H19、lncRNA-MALATl则促进了HSCs的活化。LncRNA有望作为调节HSCs的活化控制肝纤维化的潜在靶点。