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上游开放阅读框架(uORF)是真核生物中普遍存在的调控元件，并具有广泛的翻译活性。uORF通过隔离核糖体来调节下游编码序列(CDS)的翻译起始率。已有研究证实uORF介导的翻译调控是一种常见的基因表达抑制机制。中国科学家最近在植物中通过CRISPR/Cas9技术高效编辑uORF来操纵mRNA翻译而调控蛋白质水平，最终影响表型。这为植物分子生物学研究及遗传育种提供了新的途径。由于uORF在动植物基因中都普遍存在。在斑马鱼中超过62.6%的基因的上游区域存在至少一个uORF。因此，在鱼类中通过编辑uORF来调控鱼类性状成为可能。改善鱼类生长一直是基因工程的主要目标之一，这一过程主要通过调控脑垂体合成和分泌生长激素(GH)来进行。本文使用CRISPR/Cas9系统对斑马鱼生长激素(GH1)基因的上游开放阅读框的起始密码子(ATGs)进行基因编辑。探讨了在鱼类中通过编辑uORF操控基因的表达。
主要内容如下：
1.斑马鱼GH1基因uORF可突变位点筛选
斑马鱼GH1基因共检索出起始密码子为‘ATG’的uORF序列共21条，选取8条长度小于等于60bp碱基的正向uORF序列作为基因编辑的候选序列。通过比对PAM(NGG)所处位置，找出可能编辑序列包含uORF起始密码子‘ATG’的所有gRNA可能位点。最终筛选出4个基因敲除靶位点，分别位于uORF6和uORF9上。经过比对分析，所有4条候选gRNA预测没有脱靶，并且都位于3号染色体上。
2.斑马鱼GH1基因uORF定点基因编辑
我们通过体外转录获得Cas9mRNA与4条候选的gRNA。然后利用显微注射技术对斑马鱼胚胎进行基因编辑。实验共进行了10次，每次显微注射胚胎200-300枚。显微注射后的斑马鱼胚胎发育正常，并能饲养至性成熟。在受精后24小时，收集上述显微注射的斑马鱼胚胎，测序检测基因编辑是否成功。根据测序的峰图和碱基序列来初步获得插入或缺失的信息。结果显示gRNA1引导的基因编辑对uORF起始密码子ATG进行了精准敲除。如GH1-1号、GH1-3号和GH1-4号个体起始密码子完全敲除，GH1-2号个体的‘ATG’被替换为‘ATT’。
选择gRNA1作为引导链进行基因编辑实验，将基因编辑的斑马鱼胚胎精心培养至3月龄。所有成活的斑马鱼每条单独剪尾鳍后采用碱性裂解法提取DNA。采用PCR方法扩增出目的编辑片段，然后测序分析。一共检测50尾鱼，47条基因编辑成功，敲除效率达到94%。
3.斑马鱼GH1基因uORF突变体的检测
首先，通过荧光定量PCR检测mRNA水平。结果显示，在48hpf时，GH1刚刚开始转录，此时，基因编辑实验组和对照组的mRNA水平没有变化。从100hpf往后至15dpf，基因编辑实验组比对照组的GH1转录水平要高。且在5dpf时，实验组GH1的转录水平达到最大值，约为对照组的20倍。综上结果显示，GH1基因的uORF的起始密码子敲除后，可以影响下游的GH1基因的表达。
其次，通过蛋白免疫印迹技术检测蛋白水平。结果显示，基因编辑后基因型纯合个体(uORF6GH1-AA)的自交后代与对照组AB野生型相比，GH1蛋白水平明显要高。
最后，检测基因编辑后的个体发育水平。结果显示，不管是GH1基因差异表较大时期的幼体，还是性成熟的个体。在个体发育水平上实验组和野生型斑马鱼并没有区别。说明尽管基因编辑成功，但是没有出现具有表型的个体。
本论文利用CRISPR/Cas9系统编辑斑马鱼生长激素基因的上游开放阅读框，通过提高蛋白质翻译效率，增加了目标基因蛋白表达的水平。虽然没有明显改善斑马鱼的生长发育，但是也证明了CRISPR/Cas9系统对鱼类基因的上游开放阅读框的编辑是有效的。本研究扩大了CRISPR/Cas9系统对鱼类等动物在基因组上调控区域的编辑来影响基因表达的使用方法，而非传统的突变该基因致使该基因降低或失去功能，为CRISPR/Cas9体系应用于鱼类遗传育种提供了新的思路。
主要内容如下：
1.斑马鱼GH1基因uORF可突变位点筛选
斑马鱼GH1基因共检索出起始密码子为‘ATG’的uORF序列共21条，选取8条长度小于等于60bp碱基的正向uORF序列作为基因编辑的候选序列。通过比对PAM(NGG)所处位置，找出可能编辑序列包含uORF起始密码子‘ATG’的所有gRNA可能位点。最终筛选出4个基因敲除靶位点，分别位于uORF6和uORF9上。经过比对分析，所有4条候选gRNA预测没有脱靶，并且都位于3号染色体上。
2.斑马鱼GH1基因uORF定点基因编辑
我们通过体外转录获得Cas9mRNA与4条候选的gRNA。然后利用显微注射技术对斑马鱼胚胎进行基因编辑。实验共进行了10次，每次显微注射胚胎200-300枚。显微注射后的斑马鱼胚胎发育正常，并能饲养至性成熟。在受精后24小时，收集上述显微注射的斑马鱼胚胎，测序检测基因编辑是否成功。根据测序的峰图和碱基序列来初步获得插入或缺失的信息。结果显示gRNA1引导的基因编辑对uORF起始密码子ATG进行了精准敲除。如GH1-1号、GH1-3号和GH1-4号个体起始密码子完全敲除，GH1-2号个体的‘ATG’被替换为‘ATT’。
选择gRNA1作为引导链进行基因编辑实验，将基因编辑的斑马鱼胚胎精心培养至3月龄。所有成活的斑马鱼每条单独剪尾鳍后采用碱性裂解法提取DNA。采用PCR方法扩增出目的编辑片段，然后测序分析。一共检测50尾鱼，47条基因编辑成功，敲除效率达到94%。
3.斑马鱼GH1基因uORF突变体的检测
首先，通过荧光定量PCR检测mRNA水平。结果显示，在48hpf时，GH1刚刚开始转录，此时，基因编辑实验组和对照组的mRNA水平没有变化。从100hpf往后至15dpf，基因编辑实验组比对照组的GH1转录水平要高。且在5dpf时，实验组GH1的转录水平达到最大值，约为对照组的20倍。综上结果显示，GH1基因的uORF的起始密码子敲除后，可以影响下游的GH1基因的表达。
其次，通过蛋白免疫印迹技术检测蛋白水平。结果显示，基因编辑后基因型纯合个体(uORF6GH1-AA)的自交后代与对照组AB野生型相比，GH1蛋白水平明显要高。
最后，检测基因编辑后的个体发育水平。结果显示，不管是GH1基因差异表较大时期的幼体，还是性成熟的个体。在个体发育水平上实验组和野生型斑马鱼并没有区别。说明尽管基因编辑成功，但是没有出现具有表型的个体。
本论文利用CRISPR/Cas9系统编辑斑马鱼生长激素基因的上游开放阅读框，通过提高蛋白质翻译效率，增加了目标基因蛋白表达的水平。虽然没有明显改善斑马鱼的生长发育，但是也证明了CRISPR/Cas9系统对鱼类基因的上游开放阅读框的编辑是有效的。本研究扩大了CRISPR/Cas9系统对鱼类等动物在基因组上调控区域的编辑来影响基因表达的使用方法，而非传统的突变该基因致使该基因降低或失去功能，为CRISPR/Cas9体系应用于鱼类遗传育种提供了新的思路。