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一、目的
精准高效的基因编辑系统可实现不同物种基因组的任何DNA片段的基因编辑，在靶向DNA的位点产生DNA双链断裂(DSB)。双链断裂后激发细胞的损伤修复机制包括非同源末端连接(NHEJ)修复和同源指导修复(HDR)。若能精确的在靶向位点产生DNA双链断裂形成同源指导修复，基因编辑效率可提高约1000倍，但同源指导修复实现的基因编辑效率仍较低。
目前，实现高效精准的同源指导修复技术包括锌指核酸酶、类似转录激活子的效应核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白9核酸酶(Cas9)系统。CRISPR-Cas9系统因其强大性能、简单的载体构建和操纵基因的多重性已应用于哺乳动物基因组编辑，以此来实现修复病变基因或将正确的基因拷贝整合到基因组的特定部位，治疗遗传性疾病。
CRISPR-Cas9系统在向导RNA(sgRNA )引导下，以碱基对互补方式识别protospacer毗邻基序(PAM)NGG上游靶序列DNA。然而，提高精确CRISPR-Cas9介导的基因编辑或HDR介导的敲入(KI)效率仍是一项重大挑战。
胚胎干细胞(ESCs)具有无限的自我更新能力，诱导的多能干细胞(iPSCs)是由分化的体细胞经重编程得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型，该重编程技术的出现和发展使获得病人自体细胞来源的干细胞变得非常简单。可以利用这一优势，利用基因编辑技术构建基于iPSCs的个体化基因疗法，使在体外修复致病基因，定向分化为某一类型的细胞后移植给患者成为好的治疗选择。另外，iPSCs不仅能为基因治疗提供了足够数量的来源于患者自身细胞的干细胞，也不会产生免疫排斥反应。因此，iPSCs解决了与同种异体细胞移植相关的免疫原性问题和伦理问题。
利用CRISPR-Cas9系统在体外修复iPSCs中的致病基因仍需解决下列问题：基因编辑技术：1)CRISPR-Cas9系统在基因编辑中存在脱靶效应，造成了基因治疗的安全隐患；2)利用CRISPR-Cas9系统编辑iPSCs的效率低下(~1％)，筛选难度大，耗时耗力；3)iPSCs在体外电转后死亡率高，增加了基因编辑的难度。
CRISPR-Cas9系统组件的改良和合理设计都可能提高基因编辑效率和减少脱靶效应，实现在不同类型细胞中高水平的基因编辑。因此，本课题从提高细胞存活率、优化模板设计这两个方面进行研究，首次应用BCL-XL瞬时过表达和加入内含子的新型模板策略提高iPSCs的基因编辑效率，为利用CRISPR系统和干细胞进行个体化基因治疗和再生医学中的应用治疗提供新的理论依据。
二、实验方法
(一)通过瞬时BCL-XL过表达实现CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中高效的基因编辑
(1)制备CRISPR-Cas9系统各组件及过表达载体的质粒的质粒
1.使用NEBuilderHiFiDNA组装试剂盒构建质粒(Cas9、sgRNA、pDonor、BCL-XL、BCL2和MCL1)；
2.将构建的质粒转化至感受态细胞；
3.质粒小提；
4.测序鉴定质粒：用NCBIblast比对获得的样本序列；
5.质粒中提和大提。
(2)sgRNA设计
利用CHOPCHOP网站设计靶向GFP(sgDocut)，人EEF1A1、GAPDH、PRDM14、CTNNB1、OCT4、AAVS1、CD326位点的sgRNA，优先选择在5端具有碱基G的sgRNAs，启动U6-启动子介导的转录。
(3)体外培养iPSCs、K562细胞、Jurkat细胞和HEK293T细胞，待转染。
(4)稳定BCL-XL过表达对电转后iPSCs细胞存活率和CRISPR组分质粒拷贝数的影响
1.利用电转技术将CRISPR-Cas9各组件质粒(BCL-XL组：加入BCL-XL质粒；Control组：无BCL-XL质粒)转染到iPSCs；
2.实时定量PCR技术动态监测电转后BCL-XL组及Control组iPSCs中有效基因编辑的CRISPR组分的质粒拷贝数；
3.实时动态影像学观察电转后BCL-XL组及Control组iPSCs在不同时间的生长情况。
(5)不同BCL-XL质粒量在瞬时转染后细胞内表达的时间依赖性和高水平KI效率的质粒量的确定
1.利用电转技术将CRISPR-Cas9各组件质粒转染到iPSCs，加入不同量的BCL-XL，比较0.5?g、1.0?g的BCL-XL在瞬时转染后细胞内表达的时间依赖性。比较0?g、0.1?g、0.25?g、0.5?g、1?g和2?g的细胞存活率及KI效率；
2.通过RT-qPCR检测电转后BCL-XLmRNA水平的变化，确认表达高峰期；
3.通过流式细胞技术(FACS)测定BCL-XL在蛋白水平的变化，确认表达的高峰期；
4.实时动态影像学观察电转1天后iPSCs细胞的存活率；
5.FACS检测电转后第3天的HDR-KI效率。
(6)BCL-XL、BCL2和MCL1对iPSCs细胞生存和基因编辑效果的比较
1.利用电转技术将CRISPR-Cas9各组件质粒转染到iPSCs，加入0.5?g不同BCL2家族成员质粒：BCL-XL、BCL2和MCL1。对照组不加入质粒；
2.观察电转后各组iPSCs的生长；
3.转染后3天收集iPSCs细胞样品进行PCR扩增待测序；
4.通过深度测序和Sanger测序分析NHEJ/HDR编辑和脱靶切割测定基因编辑效率并比较分析。
(7)BCL2家族在K562、Jurkat和HEK293T细胞的基因编辑效率比较
1.利用电转技术将CRISPR-Cas9各组件质粒转染到K562、Jurkat细胞，加入0.5μg不同BCL2家族成员质粒：BCL-XL、BCL2和MCL1。对照组不加入质粒；
2.利用Lipo3000脂质体转染HEK293T细胞，分别加入0.5μg不同BCL2家族成员质粒：BCL-XL、BCL2和MCL1。对照组不加入质粒；
3.FACS测定转染后第3天的HDR-KI效率。
(8)BCL-XL过表达对染色体表型的影响
1．利用电转技术将CRISPR-Cas9各组件质粒转染到iPSCs、K562细胞、Jurkat细胞和HEK293T细胞；
2.使用IlluminaHumanCoreExomeBeadChip系统对BCL2家族成员参与的转染后细胞进行染色体数字核型分析。
(二)新型模板使CRISPR-Cas9系统精准基因编辑效率大幅度提高
(1)制备CRISPR-Cas9系统各组件及过表达载体质粒。体外培养iPSCs和K562细胞，待电转，同第一部分。
(2)优化EEF1A1位点新型模板对K562细胞和iPSCsKI效率的影响
1.设计插入EEF1A1基因第6内含子结构的新型模板：pDonor-In6，以无内含子插入模板作对照；
2.电转K562和iPSCs细胞，FACS测定pDonor-In6组和pDonor-Ctrl组的KI效率。
(3)优化GAPDH位点新型模板对iPSCsKI效率的影响
1.设计插入GAPDH基因第8内含子结构的新型模板：pDonor-In8，以无内含子插入模板作对照；
2.电转iPSCs，FACS测定pDonor-In8组和pDonor-Ctrl组的KI效率。
(4)优化OCT4位点新型模板对iPSCsKI效率的影响
1.设计插入OCT4基因第4内含子和EEF1A1位点第6内含子结构的两个新型模板：以无内含子插入模板作对照；
2.电转iPSCs，FACS测定pDonor-EF1In6组、pDonor-In4组和pDonor-Ctrl组的KI效率。
三、结果
(一)通过瞬时BCL-XL过表达实现CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中高效的基因编辑
(1)BCL-XL过表达对电转后iPSCs细胞存活率及CRISPR组分的质粒拷贝数的影响
1.未添加BCL-XL组(对照组)的iPSCs在电转后出现大量死亡细胞，添加BCL-XL组细胞死亡数量明显少于对照组；
2.BCL-XL组有效的基因编辑的CRISPR组分的质粒拷贝数明显高于对照组。
(2)不同BCL-XL质粒量在瞬时转染后细胞内表达的时间依赖性及实现高水平KI效率的质粒量的确定
1.BCL-XL0.5μg组和1μg组在转染后12–24小时均有高水平BCL-XL表达，随后BCL-XL水平显著下降；
2.BCL-XL剂量与细胞存活及基因编辑效率有关，0.1μgBCL-XL质粒已可大大促进iPSCs存活和增强基因编辑，当BCL-XL剂量逐渐增加时效果更好(0.25μg-1μg)。但当剂量增加至2μg时iPSCs存活和HDR介导的KI效果呈下降趋势。
(3)BCL-XL、BCL2和MCL1对iPSCs细胞生存和基因编辑效果的比较
1.BCL2适度提高了HDR介导的KI效率，改善了NHEJ介导的KO效率，提高了细胞存活率；
2.MCL1对KI和KO效率均无显著提高，MCL1处理后未提高细胞的存活率；
3.无论使用哪一种模板供体，在EEF1A1、GAPDH和CD326位点观察到的NHEJ和HDR编辑水平均高于AAVS1，在这三个具有较高编辑水平的基因座上，BCL-XL和BCL2均显著提高了NHEJ和HDR的编辑效率，BCL-XL的基因编辑效率更高，是BCL2或MCL1无法代替的。
(4)BCL2家族在K562、Jurkat和HEK293T细胞中基因编辑效率的比较
1.BCL家族成员处理后，电穿孔不会增加细胞存活率；
2.BCL2显著降低了EEF1A1和GAPDH的HDR效率；
3.K562细胞中，BCL-XL和MCL1处理后没有明显受益；
4.Jurkat细胞中，BCL-XL和MCL1处理后基因编辑效率增强。
(5)BCL-XL过表达对染色体表型的影响
1.BCL-XL瞬时过表达不影响电转后iPSCs的染色体表型；
2.电转后的Jurkat、K562和HEK293T肿瘤细胞系，染色体存在大量异常。
(二)新型模板使CRISPR-Cas9系统精准基因编辑效率大幅度提高
(1)优化EEF1A1位点新型模板对K562细胞及iPSCsKI效率的影响
1.K562细胞中新型模板的KI效率(71％)比对照组(55％)高16％，将原有模板组的KI效率提高29％(71-55/55)；
2.iPSCs中新型模板的KI效率(47％)比对照组(27％)高20％，将原有模板组的KI效率提高74％(47-27/27)。
(2)优化GAPDH位点新型模板对iPSCsKI效率的影响
新型模板的KI效率(28％)比对照组(18％)高10％，将原有模板组的KI效率提高56％(28-18/18)。
(3)优化OCT4位点新型模板对iPSCsKI效率的影响
pDonor-EF1In6获得了最高的KI效率，所有组在电转后第18天的KI效率最高，分别为pDonor-EF1In6组51％、pDonor-In4组33％、pDonor-no-In组25％。与对照组相比分别提高26％和6％，将原有模板组的KI效率提高了104％(51-25/25)和32％(33-25/25)。
四、结论
1.BCL-XL过表达可提高电转后iPSCs细胞的存活率和CRISPR组分的质粒拷贝数，提高iPSCs的基因编辑效率。
2.iPSCs中0.25μg-1μg的BCL-XL质粒可实现高的HDR效率，在CRISPR-Cas9系统中加入0.5μg的BCL-XL即可提高细胞生存和基因编辑。
3.0.5μg的BCL-XL瞬时过表达不影响iPSCs染色体表型，使用BCL-XL进行的基因组编辑是安全的。
4.根据基因编辑效率及染色体数字核型分析结果，不推荐BCL2家族应用于K562、Jurkat和HEK293T细胞的基因编辑。
5.在模板设计中加入内含子序列可弥补CRISPR-Cas9系统在基因编辑后引起的靶位点处内含子缺失。在HDR后内含子随目的基因一起插入到靶位点，代替敲除的内含子行使相应功能，大大提高了目的基因表达。
精准高效的基因编辑系统可实现不同物种基因组的任何DNA片段的基因编辑，在靶向DNA的位点产生DNA双链断裂(DSB)。双链断裂后激发细胞的损伤修复机制包括非同源末端连接(NHEJ)修复和同源指导修复(HDR)。若能精确的在靶向位点产生DNA双链断裂形成同源指导修复，基因编辑效率可提高约1000倍，但同源指导修复实现的基因编辑效率仍较低。
目前，实现高效精准的同源指导修复技术包括锌指核酸酶、类似转录激活子的效应核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白9核酸酶(Cas9)系统。CRISPR-Cas9系统因其强大性能、简单的载体构建和操纵基因的多重性已应用于哺乳动物基因组编辑，以此来实现修复病变基因或将正确的基因拷贝整合到基因组的特定部位，治疗遗传性疾病。
CRISPR-Cas9系统在向导RNA(sgRNA )引导下，以碱基对互补方式识别protospacer毗邻基序(PAM)NGG上游靶序列DNA。然而，提高精确CRISPR-Cas9介导的基因编辑或HDR介导的敲入(KI)效率仍是一项重大挑战。
胚胎干细胞(ESCs)具有无限的自我更新能力，诱导的多能干细胞(iPSCs)是由分化的体细胞经重编程得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型，该重编程技术的出现和发展使获得病人自体细胞来源的干细胞变得非常简单。可以利用这一优势，利用基因编辑技术构建基于iPSCs的个体化基因疗法，使在体外修复致病基因，定向分化为某一类型的细胞后移植给患者成为好的治疗选择。另外，iPSCs不仅能为基因治疗提供了足够数量的来源于患者自身细胞的干细胞，也不会产生免疫排斥反应。因此，iPSCs解决了与同种异体细胞移植相关的免疫原性问题和伦理问题。
利用CRISPR-Cas9系统在体外修复iPSCs中的致病基因仍需解决下列问题：基因编辑技术：1)CRISPR-Cas9系统在基因编辑中存在脱靶效应，造成了基因治疗的安全隐患；2)利用CRISPR-Cas9系统编辑iPSCs的效率低下(~1％)，筛选难度大，耗时耗力；3)iPSCs在体外电转后死亡率高，增加了基因编辑的难度。
CRISPR-Cas9系统组件的改良和合理设计都可能提高基因编辑效率和减少脱靶效应，实现在不同类型细胞中高水平的基因编辑。因此，本课题从提高细胞存活率、优化模板设计这两个方面进行研究，首次应用BCL-XL瞬时过表达和加入内含子的新型模板策略提高iPSCs的基因编辑效率，为利用CRISPR系统和干细胞进行个体化基因治疗和再生医学中的应用治疗提供新的理论依据。
二、实验方法
(一)通过瞬时BCL-XL过表达实现CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中高效的基因编辑
(1)制备CRISPR-Cas9系统各组件及过表达载体的质粒的质粒
1.使用NEBuilderHiFiDNA组装试剂盒构建质粒(Cas9、sgRNA、pDonor、BCL-XL、BCL2和MCL1)；
2.将构建的质粒转化至感受态细胞；
3.质粒小提；
4.测序鉴定质粒：用NCBIblast比对获得的样本序列；
5.质粒中提和大提。
(2)sgRNA设计
利用CHOPCHOP网站设计靶向GFP(sgDocut)，人EEF1A1、GAPDH、PRDM14、CTNNB1、OCT4、AAVS1、CD326位点的sgRNA，优先选择在5端具有碱基G的sgRNAs，启动U6-启动子介导的转录。
(3)体外培养iPSCs、K562细胞、Jurkat细胞和HEK293T细胞，待转染。
(4)稳定BCL-XL过表达对电转后iPSCs细胞存活率和CRISPR组分质粒拷贝数的影响
1.利用电转技术将CRISPR-Cas9各组件质粒(BCL-XL组：加入BCL-XL质粒；Control组：无BCL-XL质粒)转染到iPSCs；
2.实时定量PCR技术动态监测电转后BCL-XL组及Control组iPSCs中有效基因编辑的CRISPR组分的质粒拷贝数；
3.实时动态影像学观察电转后BCL-XL组及Control组iPSCs在不同时间的生长情况。
(5)不同BCL-XL质粒量在瞬时转染后细胞内表达的时间依赖性和高水平KI效率的质粒量的确定
1.利用电转技术将CRISPR-Cas9各组件质粒转染到iPSCs，加入不同量的BCL-XL，比较0.5?g、1.0?g的BCL-XL在瞬时转染后细胞内表达的时间依赖性。比较0?g、0.1?g、0.25?g、0.5?g、1?g和2?g的细胞存活率及KI效率；
2.通过RT-qPCR检测电转后BCL-XLmRNA水平的变化，确认表达高峰期；
3.通过流式细胞技术(FACS)测定BCL-XL在蛋白水平的变化，确认表达的高峰期；
4.实时动态影像学观察电转1天后iPSCs细胞的存活率；
5.FACS检测电转后第3天的HDR-KI效率。
(6)BCL-XL、BCL2和MCL1对iPSCs细胞生存和基因编辑效果的比较
1.利用电转技术将CRISPR-Cas9各组件质粒转染到iPSCs，加入0.5?g不同BCL2家族成员质粒：BCL-XL、BCL2和MCL1。对照组不加入质粒；
2.观察电转后各组iPSCs的生长；
3.转染后3天收集iPSCs细胞样品进行PCR扩增待测序；
4.通过深度测序和Sanger测序分析NHEJ/HDR编辑和脱靶切割测定基因编辑效率并比较分析。
(7)BCL2家族在K562、Jurkat和HEK293T细胞的基因编辑效率比较
1.利用电转技术将CRISPR-Cas9各组件质粒转染到K562、Jurkat细胞，加入0.5μg不同BCL2家族成员质粒：BCL-XL、BCL2和MCL1。对照组不加入质粒；
2.利用Lipo3000脂质体转染HEK293T细胞，分别加入0.5μg不同BCL2家族成员质粒：BCL-XL、BCL2和MCL1。对照组不加入质粒；
3.FACS测定转染后第3天的HDR-KI效率。
(8)BCL-XL过表达对染色体表型的影响
1．利用电转技术将CRISPR-Cas9各组件质粒转染到iPSCs、K562细胞、Jurkat细胞和HEK293T细胞；
2.使用IlluminaHumanCoreExomeBeadChip系统对BCL2家族成员参与的转染后细胞进行染色体数字核型分析。
(二)新型模板使CRISPR-Cas9系统精准基因编辑效率大幅度提高
(1)制备CRISPR-Cas9系统各组件及过表达载体质粒。体外培养iPSCs和K562细胞，待电转，同第一部分。
(2)优化EEF1A1位点新型模板对K562细胞和iPSCsKI效率的影响
1.设计插入EEF1A1基因第6内含子结构的新型模板：pDonor-In6，以无内含子插入模板作对照；
2.电转K562和iPSCs细胞，FACS测定pDonor-In6组和pDonor-Ctrl组的KI效率。
(3)优化GAPDH位点新型模板对iPSCsKI效率的影响
1.设计插入GAPDH基因第8内含子结构的新型模板：pDonor-In8，以无内含子插入模板作对照；
2.电转iPSCs，FACS测定pDonor-In8组和pDonor-Ctrl组的KI效率。
(4)优化OCT4位点新型模板对iPSCsKI效率的影响
1.设计插入OCT4基因第4内含子和EEF1A1位点第6内含子结构的两个新型模板：以无内含子插入模板作对照；
2.电转iPSCs，FACS测定pDonor-EF1In6组、pDonor-In4组和pDonor-Ctrl组的KI效率。
三、结果
(一)通过瞬时BCL-XL过表达实现CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中高效的基因编辑
(1)BCL-XL过表达对电转后iPSCs细胞存活率及CRISPR组分的质粒拷贝数的影响
1.未添加BCL-XL组(对照组)的iPSCs在电转后出现大量死亡细胞，添加BCL-XL组细胞死亡数量明显少于对照组；
2.BCL-XL组有效的基因编辑的CRISPR组分的质粒拷贝数明显高于对照组。
(2)不同BCL-XL质粒量在瞬时转染后细胞内表达的时间依赖性及实现高水平KI效率的质粒量的确定
1.BCL-XL0.5μg组和1μg组在转染后12–24小时均有高水平BCL-XL表达，随后BCL-XL水平显著下降；
2.BCL-XL剂量与细胞存活及基因编辑效率有关，0.1μgBCL-XL质粒已可大大促进iPSCs存活和增强基因编辑，当BCL-XL剂量逐渐增加时效果更好(0.25μg-1μg)。但当剂量增加至2μg时iPSCs存活和HDR介导的KI效果呈下降趋势。
(3)BCL-XL、BCL2和MCL1对iPSCs细胞生存和基因编辑效果的比较
1.BCL2适度提高了HDR介导的KI效率，改善了NHEJ介导的KO效率，提高了细胞存活率；
2.MCL1对KI和KO效率均无显著提高，MCL1处理后未提高细胞的存活率；
3.无论使用哪一种模板供体，在EEF1A1、GAPDH和CD326位点观察到的NHEJ和HDR编辑水平均高于AAVS1，在这三个具有较高编辑水平的基因座上，BCL-XL和BCL2均显著提高了NHEJ和HDR的编辑效率，BCL-XL的基因编辑效率更高，是BCL2或MCL1无法代替的。
(4)BCL2家族在K562、Jurkat和HEK293T细胞中基因编辑效率的比较
1.BCL家族成员处理后，电穿孔不会增加细胞存活率；
2.BCL2显著降低了EEF1A1和GAPDH的HDR效率；
3.K562细胞中，BCL-XL和MCL1处理后没有明显受益；
4.Jurkat细胞中，BCL-XL和MCL1处理后基因编辑效率增强。
(5)BCL-XL过表达对染色体表型的影响
1.BCL-XL瞬时过表达不影响电转后iPSCs的染色体表型；
2.电转后的Jurkat、K562和HEK293T肿瘤细胞系，染色体存在大量异常。
(二)新型模板使CRISPR-Cas9系统精准基因编辑效率大幅度提高
(1)优化EEF1A1位点新型模板对K562细胞及iPSCsKI效率的影响
1.K562细胞中新型模板的KI效率(71％)比对照组(55％)高16％，将原有模板组的KI效率提高29％(71-55/55)；
2.iPSCs中新型模板的KI效率(47％)比对照组(27％)高20％，将原有模板组的KI效率提高74％(47-27/27)。
(2)优化GAPDH位点新型模板对iPSCsKI效率的影响
新型模板的KI效率(28％)比对照组(18％)高10％，将原有模板组的KI效率提高56％(28-18/18)。
(3)优化OCT4位点新型模板对iPSCsKI效率的影响
pDonor-EF1In6获得了最高的KI效率，所有组在电转后第18天的KI效率最高，分别为pDonor-EF1In6组51％、pDonor-In4组33％、pDonor-no-In组25％。与对照组相比分别提高26％和6％，将原有模板组的KI效率提高了104％(51-25/25)和32％(33-25/25)。
四、结论
1.BCL-XL过表达可提高电转后iPSCs细胞的存活率和CRISPR组分的质粒拷贝数，提高iPSCs的基因编辑效率。
2.iPSCs中0.25μg-1μg的BCL-XL质粒可实现高的HDR效率，在CRISPR-Cas9系统中加入0.5μg的BCL-XL即可提高细胞生存和基因编辑。
3.0.5μg的BCL-XL瞬时过表达不影响iPSCs染色体表型，使用BCL-XL进行的基因组编辑是安全的。
4.根据基因编辑效率及染色体数字核型分析结果，不推荐BCL2家族应用于K562、Jurkat和HEK293T细胞的基因编辑。
5.在模板设计中加入内含子序列可弥补CRISPR-Cas9系统在基因编辑后引起的靶位点处内含子缺失。在HDR后内含子随目的基因一起插入到靶位点，代替敲除的内含子行使相应功能，大大提高了目的基因表达。