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青蒿素是存在于中药青蒿(Artemiss annua L.)中的一种含有过氧桥的倍半萜内酯化合物,是中国科学家研发出的当今最有潜力的抗疟药剂,较传统抗疟药很少或无毒副作用,因此青蒿素的生产备受人们关注。目前,青蒿素的生产主要以植物提取为主,但由于青蒿植株中青蒿素的含量很低(约占干重的0.01％～0.8％),从而导致青蒿素价格昂贵,使许多贫困地区的疟疾患者无法得到医治,故提高青蒿植株中青蒿素的含量或扩大青蒿素的来源,降低生产青蒿素的成本具有重要的意义。
本论文基于扩大青蒿素的来源和提高青蒿植株中青蒿素含量的目的,开展了以下两方面的工作:
一、紫穗槐二烯在烟草中组合生物合成的研究
紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase,ADS)是青蒿素生物合成的关键酶之一,为了能在烟草中合成青蒿素的前体,本研究将青蒿的紫穗槐二烯合酶基因置于CaMV35S启动子控制下,通过根癌农杆菌介导转入烟草(Nicotiana tobacum L.),并获得了转ADS基因烟草植株。经PCR及Southern杂交分析表明,ADS基因已经整合到转基因烟草基因组中；RT—PCR及对转基因烟草中ADS酶活性和产物中紫穗槐二烯和植物甾醇的测定分析,进一步证明整合的ADS基因在转录、翻译水平上均已经表达。上述结果表明,利用基因工程将青蒿素生物合成途径的关键酶基因导入植物,转基因植物中能够合成青蒿素的前体,这一研究结果为利用转基因植物生产青蒿素或其前体奠定了基础。
二、青蒿鲨烯合酶双链干涉基因对烟草的遗传转化研究
鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)是甾醇类生物合成分支途径的关键酶之一,利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)抑制目标基因表达的技术已日趋成熟。本文根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理,在与烟草SQS同源性高达80％的青蒿ASQS序列的5端保守区选择622 bp作为构建RNAi的序列,借助中间克隆载体,经过三次亚克隆,最后形成含ASQS—RNAi表达盒的双元表达载体pART27-ASQS,并转入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导的烟草叶盘转化法,共获得了12棵转基因植株。转基因植株经过PCR和PCR—Southern blotting检测,证实外源ASQS基因已经导入烟草中,并已经成功整合到烟草基因组中；通过RT—PCR分析说明,转基因烟草中SOS基因的表达已被成功抑制,部分转基因植株中内源SOS的干扰效果高达90％以上。对SOS的直接产物鲨烯和最终产物植物甾醇的检测显示,转基因烟草的植物甾醇和鲨烯的含量明显低于对照。本实验的结果为下一步将此RNA干扰载体导入青蒿,抑制青蒿中ASQS基因的表达,从而提高青蒿素的含量提供了可能。