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大豆是重要的油料作物和粮食作物,是世界上食用油和植物蛋白的主要来源,同时,大豆又是植物功能基因组研究中的重要模式植物,因此发展高效的大豆遗传转化系统具有重要的现实和理论意义。
在本研究中,通过对一系列影响农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化因素的研究,建立了一套优化的大豆遗传转化系统。
研究结果表明:超毒力菌株EHA105在受试的3个农杆菌菌株中(EHA105、LBA4404和GV3101)具有最强的转化能力;农杆菌侵染大豆子叶节前,短期(1 d)在高渗培养基上的预培养可以提高农杆菌对某些大豆品种的转化;在农杆菌侵染液中添加0.02%(v/v)的表面活性剂Silwet L-77,在侵染液和共培养培养基中同时添加乙酰丁香酮(200 μ mol/L)和抗坏血酸(50 mg/L),都能显著促进转化效率的提高。较低的共培养温度(22℃)有利于农杆菌对大豆子叶节的转化从而提高转化效率。农杆菌与子叶节共培养结束,两种抗生素结合使用(250 mg/L羧苄霉青素+100 mg/L头孢霉素)可以有效抑制农杆菌的过度繁殖,并降低抗生素对外植体分化的不利影响。
在对感染外植体施加选择压进行筛选以前,进行一定时间的恢复培养(7 d),并逐步提高筛选压的强度可以提高被转化外植体的存活率和分化率。将这些优化后的积极因素组合到一起,形成一套优化的大豆子叶节转化系统。利用这一系统,成功实现了对国内大面积推广的5个大豆品种的转化,转化效率为2.0-7.6%。对转化植株的PCR、Southern blot以及GUS检测分析表明T-DNA上的外源基因已经稳定整合进了大豆基因组并得到表达。此优化转化系统的建立,为将优良基因广泛导入大豆基因组,培养优良的大豆品种奠定了基础。
优良的大豆再生体系是建立高效的大豆遗传转化系统,解决当前大豆遗传转化效率不高等问题的前提条件。大豆体细胞胚发生的再生系统以其独特的优点成为发展高效大豆遗传转化系统的潜在再生系统。在本研究中,通过对影响大豆体细胞胚发生过程的各种因素的探讨,建立了一套高效的大豆体细胞发生的再生系统。
研究表明,未成大豆熟子叶在5-10 μ E m-2~S-1的光照强度下培养,最有利于体细胞胚的诱导;长度为2-6 mm的未成熟子叶最适合作为体细胞胚诱导的外植体;在分化培养基中添加0.4-0.5%浓度的活性炭,可以有效促进大豆体细胞胚的正常分化;3-4 d的干燥处理可以显著提高成熟体细胞胚的萌发率。8个国内大面积种植的大豆品种在体细胞诱导和转换成小植株的过程中表现出明显的基因型差异,但都由未成熟子叶诱导得到体细胞胚,并成功发育为植株,其中合丰25的再生频率最高,达到32.3%。
另外,研究还发现,一定浓度和时间的腐胺处理,可以有效促进未成熟子叶胚性愈伤组织的诱导,并进一步诱导出体细胞胚,这一发现为发展农杆菌介导的大豆体细胞胚转化系统开辟了另外一条途径。