论文部分内容阅读
[目的]建立大鼠外伤性嗅觉障碍模型，观察不同时间点嗅神经解剖及嗅黏膜组织学的变化；在嗅球和筛板之间移植同种异体嗅鞘细胞(olfactoryensheathing cells，OECs)，探讨其对嗅神经离断后嗅感觉神经元(olfactory recptorneurons，ORNs)再生的影响。
[方法]
1.造模方法验证(预实验)：选取5只成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，经鼻骨开窗后电刺激嗅黏膜，从颅骨外记录嗅觉诱发电位(olfactory evokedpotentials，OEPs)，观察其在神经切断前后的变化，并行神经示踪观察嗅神经的连续性。
2.外伤性嗅觉障碍大鼠模型嗅上皮组织学观察：选取60只成年雄性SD大鼠，随机分为手术组(40只)和对照组(20只)，每组又分为5个时间点。在解剖显微镜下暴露所有大鼠左侧嗅球并沿筛板离断手术组大鼠左侧嗅神经。术后1天、5天、2周、3周、6周处理动物。处理前24小时，每组取2只大鼠经鼻腔滴注30％辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)。取出大鼠鼻中隔及嗅球，冰冻切片行HE染色、TUNEL及TMB显色，观察嗅上皮的厚度、上皮中细胞数量的变化以及嗅黏膜和嗅球之间的神经连接，并且行免疫组化观察嗅上皮中再生嗅感觉神经元(ORNs)的数量和分布。采用SPSS11.0统计软件包分析大鼠嗅上皮厚度和细胞数量的变化。
3.嗅鞘细胞(OECs)移植对嗅神经离断后嗅上皮恢复的影响：分离培养大鼠嗅球OECs，采用免疫组化鉴定。选取40只成年雄性SD大鼠，随机分为细胞移植组(24只)和对照组(16只)，每组又分为4个时间点。解剖显微镜下离断大鼠左侧嗅神经，在移植组大鼠的嗅球和筛板之间植入荧光素标记的OECs，在对照组大鼠的同一位置注射DMEM/F-12培养基。术后5天、2周、3周、6周处理动物，冰冻切片观察嗅上皮组织学变化，并用免疫组化及荧光显微镜观察移植OECs的分布。统计分析大鼠嗅上皮厚度和细胞数量的变化。
[结果]
1.在预实验中电刺激嗅黏膜时可以从大鼠颅骨外引出“负-正-负(N1-P1-N2)”的三相波形，嗅神经离断后同侧P1、N2波消失，N1波振幅减低，神经示踪发现大鼠嗅神经离断侧嗅球内没有阳性染色，表明嗅神经被完全离断。
2.嗅神经离断后1天，同侧嗅上皮中凋亡ORNs的数量增加，各组间嗅上皮厚度和细胞数量相比没有明显差异(P＞0.05)，嗅球中未见HRP标记的神经纤维。5天时离断侧嗅上皮中细胞数量明显减少，上皮厚度极度减低，与同一时间点对照组及不同时间点的手术组比较有非常显著性差异(P＜0.01)。术后2、3周大鼠的嗅球中出现较多HRP阳性标记的神经纤维，嗅上皮厚度和细胞数量逐渐增加，但与对照组相比有非常显著性差异(P＜0.01)，此时嗅上皮中出现大量的生长相关蛋白(growth associated protein，Gap)-43免疫阳性的新生ORNs。经过6周的恢复，手术组大鼠离断侧嗅上皮厚度及细胞数量恢复至对照组水平(P＞0.05)，嗅上皮中新生的ORNs与嗅球重新建立神经联系，上皮中仍然有较多的凋亡细胞。
3.体外培养的OECs纯化后表现为双极细胞或者扁平细胞，免疫组化染色显示特异性低亲和力神经生长因子受体(low affinity neurotrophin receptor，p75NTR)抗体阳性，证实其为OECs。荧光显微镜及免疫组化发现移植的OECs在移植区周围至少可以存在6周。移植组和对照组大鼠的嗅上皮厚度和细胞数量在同一时间点之间比较无差异(p>0.05)，而组内不同时间点之间相比有非常显著性差异(P＜0.01)。
[结论]嗅神经离断术是建立外伤性嗅觉障碍动物模型比较可靠的方法；嗅感觉神经元具有再生能力，离断大鼠嗅神经后嗅上皮可在一定时间内恢复；本实验中在嗅球与筛板之间行嗅鞘细胞移植，未观察到其对嗅神经离断后嗅上皮恢复的促进作用。