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目的：
泛素-蛋白酶体系统是真核细胞中蛋白质降解的两大主要系统之一,在细胞中的作用范围非常广泛,不仅负责降解细胞中80-90%的蛋白质,并参与调节细胞许多生命过程。由于蛋白酶体活性状态对细胞执行不同生理功能十分重要,因此蛋白酶体具有成为影响细胞功能的重要药物靶标的潜在性。目前,蛋白酶体抑制剂作为一种新兴的抗肿瘤药物,已经得到越来越多的关注和认可,其中硼替佐米(Bonezomib)已经被美国食品及药品管理局(FDA)批准用于治疗耐药的多发性骨髓瘤。
分子量150kDa的氧调节蛋白(ORP150)是内质网驻留热休克蛋白超家族中一个新的内质网相关多肽。ORP150的表达可以被许多细胞应激损伤(如:低氧、血清饥饿、局部缺血、还原剂、衣霉素处理或抗代谢药等)所诱导。有报道,ORPl50在肿瘤组织和癌细胞系中均高表达,而ORP150在肿瘤中的高表达与肿瘤对应激的抵抗以及耐药性相关。
研究表明,蛋白酶体抑制剂诱导细胞凋亡的机制与内质网应激诱导细胞凋亡的机制存在一定程度的联系。本课题组前期研究中已证明,蛋白酶体抑制剂诱导甲状腺癌细胞凋亡的过程中,内质网应激发挥着重要的作用。且相关研究表明,内质网应激所诱导的未折叠蛋白反应又调节了ORP150的表达。以上结果提示,蛋白酶体抑制剂诱导细胞凋亡时可能调控ORP150的表达,但在甲状腺癌细胞中ORP150的表达究竟是否受蛋白酶体抑制剂的调控,及其对蛋白酶体抑制剂细胞毒性的影响却不甚明了。本实验选取不同的甲状腺癌细胞系作为研究对象,探讨ORP150在蛋白酶体抑制剂诱导甲状腺癌细胞凋亡中的作用,有助于我们深入理解蛋白酶体抑制剂抗肿瘤的分子机制,为增加肿瘤对蛋白酶体抑制剂的敏感性寻找新的靶点。
方法：
1、细胞培养:培养不同的甲状腺癌细胞系(FR0、KTC1、KTC2、KTC3、8305C和8505C)。
2、应用Real-TimePCR法检测甲状腺癌细胞中对照组及实验组ORP150、GRP78、ATF4、CHOP及其它内质网应激相关基因mRNA表达的变化。
3、应用Western-blot法检测甲状腺癌细胞中对照组及实验组ORP150、GRP78、ATF4、CHOP及其它内质网应激相关蛋白的表达差异。
4、应用AnnexinV-PI双染流式细胞术检测甲状腺癌细胞中对照组及实验组细胞凋亡的变化情况。
5、利用siRNA(smallinterferingRNA)/真核表达载体转染细胞的方法,敲低/过表达ORP150、ATF4、CHOP基因,解析ORP150在蛋白酶体抑制剂诱导甲状腺癌细胞凋亡中的作用机制。
结果：
1、Real-TimePCR和Western-blot结果显示:在甲状腺癌细胞中,蛋白酶体抑制剂诱导了ORP150的表达。
2、利用siRNA敲低ATF4的表达,蛋白酶体抑制剂诱导ORP150的表达受到抑制。
3、利用siRNA敲低ORP150的表达促进了蛋白酶体抑制剂MG132介导的细胞凋亡,并且促进了MG132对转录因子CHOP表达的诱导作用。
4、细胞过表达ORP150,蛋白酶体抑制剂诱导的细胞凋亡率降低,且抑制了MG132对转录因子CHOP表达的诱导作用。
5、敲低ORP150的细胞增加了对蛋白酶体抑制剂细胞毒性的敏感性,且这种增敏效应随着CHOP的敲低而丧失。
结论：
1、蛋白酶体抑制剂MG132通过转录因子ATF4诱导甲状腺癌细胞ORP150的表达。
2、ORP150通过抑制转录因子CHOP的表达从而抑制了MG132诱导的细胞凋亡,降低了MG132的潜在抗肿瘤活性。