【摘 要】
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色醇（Tryptophol,IET）是重要的化工和医药中间体,目前工业化生产采用化学合成方法,既不绿色环保,也会产生很多副产物。利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中色醇合成途径的生物发酵法可以克服上述问题,但由于其前体物质色氨酸含量不足,野生型色醇产量很低。色氨酸所在的芳香族氨基酸途径包含三种氨基酸分支,目前研究的重点在苯丙氨酸分支和酪氨酸分支,色氨酸分支由于代谢过程
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色醇（Tryptophol,IET）是重要的化工和医药中间体,目前工业化生产采用化学合成方法,既不绿色环保,也会产生很多副产物。利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中色醇合成途径的生物发酵法可以克服上述问题,但由于其前体物质色氨酸含量不足,野生型色醇产量很低。色氨酸所在的芳香族氨基酸途径包含三种氨基酸分支,目前研究的重点在苯丙氨酸分支和酪氨酸分支,色氨酸分支由于代谢过程复杂导致碳代谢通量不足,研究较少。本研究以提高色醇产量为目的,在酿酒酵母中对分支酸途径进行代谢工程改造,解决了色氨酸分支碳通量不足的问题,首次在酿酒酵母中实现了以葡萄糖为唯一碳源高产色醇。主要研究结果如下:（1）建立了色醇前体色氨酸所在芳香族氨基酸途径碳通量检测系统。通过外源添加酪氨酸和苯丙氨酸前体苯丙酮酸（3-Phenylpyruvic acid,PP）和4-羟基苯丙酮酸（4-hydroxy-phenylpyruvate,4-HPP）,发现发酵液中对应代谢产物苯乙醇（2-Phenylethanol,PET）和对羟基苯乙醇（4-Hydroxyphenethyl alcohol,p PET）的量与前体添加量有良好的线性关系,因此使用这两种副产物和色醇来检测芳香族氨基酸途径中的碳代谢通量。（2）代谢工程模块化改造分支酸途径和艾利希途径。使用酵母质粒构建工具盒（Yeast Toolkit,YTK）构建质粒对相关基因进行表征,代谢工程改造分为以下五个模块:关键限速酶的底物反馈不敏感型突变基因ARO4K229L和TRP2S65R,S76L的过表达;色氨酸分支中TRP1,TRP3,TRP4,TRP5的过表达;竞争途径苯丙氨酸分支和酪氨酸分支关键基因ARO7的敲除;艾利希途径中相关基因的分步过表达;增加芳香族氨基酸途径前体供应相关基因的过表达。通过以上改造色氨酸分支碳代谢通量明显增加,色醇产量达到0.77 m M。（3）发酵罐生产条件的优化。在5 L发酵罐中进行了以下三种培养基和补料方式的优化:合成培养基、YPD培养基同时流加葡萄糖、YPD培养基同时流加葡萄糖并定时添加酵母提取物。最终色醇产量达到6.80 m M(1.1 g·L-1)。本研究是在酿酒酵母中以葡萄糖为唯一碳源高产色醇的首次报道,解决了色氨酸分支碳代谢通量不足的问题,为其他利用色氨酸分支相关化合物的生物合成提供了理论支持。
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